抵抗素對(duì)人肝細(xì)胞株HepG2細(xì)胞糖脂代謝的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、肥胖與2型糖尿病關(guān)系密切，其共同的病理生理特征是：胰島素抵抗(InsulinResistance，IR)。但肥胖如何導(dǎo)致IR，從而引起2型糖尿病的發(fā)生？其根本機(jī)制尚未完全明了。 脂肪組織可釋放多種脂肪因子，參與調(diào)節(jié)糖脂代謝和胰島素的敏感性。抵抗素在嚙齒類動(dòng)物中也是一種脂肪分泌因子，在體內(nèi)的試驗(yàn)表明輸注抵抗素后能極顯著增加肝糖輸出及損害肝臟胰島素作用，而特異的抵抗素反義寡脫氧核苷酸卻能抑制這種效應(yīng)，其主要機(jī)理是通過抑制腺苷酸活化蛋

2、白激酶(AMP—activatedproteinkinase，AMPK)磷酸化，上調(diào)糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖—6-磷酸酶(G6Pase)的表達(dá)。抵抗素導(dǎo)致嚙齒類動(dòng)物胰島素抵抗已得到廣泛認(rèn)可。 然而，抵抗素在人類的作用還存在爭(zhēng)議，因?yàn)槿说挚顾赝∈蟮牡挚顾卦诎被崴缴现挥?9％的同源性，而且其來源也不同，人抵抗素主要來源于外周血的單核巨噬細(xì)胞。有關(guān)人類抵抗素表達(dá)水平與肥胖、糖尿病、脂代謝紊亂之間相

3、關(guān)性的在體研究并未得出一致的結(jié)論：部分結(jié)果支持抵抗素與IR相關(guān)，但另外一些結(jié)果顯示抵抗素與IR無關(guān)。目前對(duì)人抵抗素的體外研究資料較少，且主要集中在內(nèi)皮細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞，而對(duì)胰島素敏感的靶細(xì)胞如肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞的代謝是否受人抵抗素影響及其相關(guān)機(jī)制的有關(guān)報(bào)道更少。 AMPK是細(xì)胞內(nèi)總的能量敏感器，是由兩個(gè)α亞單位(α1、α2)、兩個(gè)β亞單位(β1、β2)和3個(gè)γ亞單位(γ1、γ2、γ3)構(gòu)成的異三聚體，其中α亞基起催化

4、作用，β和γ亞基在維持三聚體穩(wěn)定性和作用底物特異性方面起重要作用。AMPK的調(diào)節(jié)主要涉及別構(gòu)調(diào)節(jié)和磷酸化修飾，其中AMPKα亞基172位蘇氨酸的磷酸化是維持其活性所必需，且只有AMPKα2的活性才與胰島素敏感性相關(guān)聯(lián)。AMPK作為機(jī)體重要的蛋白激酶，能夠調(diào)節(jié)糖、脂、蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝及其相關(guān)基因的表達(dá)，是與2型糖尿病密切相關(guān)的主要物質(zhì)。 肝臟胰島素抵抗是2型糖尿病重要病理生理基礎(chǔ)之一。大量的實(shí)驗(yàn)顯示抵抗素在嚙齒類動(dòng)物可通過抑制A

5、MPK磷酸化導(dǎo)致肝臟IR，本實(shí)驗(yàn)室前期的研究也通過重組腺病毒構(gòu)建高抵抗素血癥的小鼠模型證實(shí)了這一點(diǎn)。那么在人類抵抗素是否會(huì)損傷肝細(xì)胞糖脂代謝，其機(jī)制是否也是通過AMPK通路介導(dǎo)？AMPK通路與胰島素信號(hào)通路之間的關(guān)系如何？迄今為止有關(guān)報(bào)道很少。為此我們對(duì)人抵抗素在肝細(xì)胞糖脂代謝中的作用及其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 在本課題中我們應(yīng)用重組人抵抗素(以下簡(jiǎn)稱人抵抗素)處理人肝細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，同時(shí)采用siRNA技術(shù)抑制HepG2細(xì)胞

6、AMPKα2的表達(dá)，觀察人抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞糖脂代謝的影響及其作用機(jī)制。本課題研究的主要目的在于：①人抵抗素是否對(duì)HepG2細(xì)胞的葡萄糖代謝產(chǎn)生影響？如果有影響，將進(jìn)一步闡明其機(jī)制是否依賴AMPK途徑。②人抵抗素是否對(duì)HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)代謝產(chǎn)生影響？如果有影響，將進(jìn)一步闡明其機(jī)制是否依賴AMPK途徑？③人抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路是否有影響？胰島素信號(hào)通路與AMPK通路之間的關(guān)系如何？ 依據(jù)研究目的，本課題研究?jī)?nèi)

7、容主要包括四個(gè)部分： 1.采用siRNA技術(shù)抑制AMPKα2在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)。 2.探討人抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖代謝的影響及其相關(guān)機(jī)制。 3.模擬體內(nèi)較高濃度的游離飽和脂肪酸的環(huán)境，探討人抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響及其相關(guān)機(jī)制。 4.探討人抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的影響。 第一部分siRNA抑制HepG2細(xì)胞AMPKα2基因的表達(dá)研究 目的:利用siRN

8、A技術(shù)抑制HepG2細(xì)胞AMPKα2基因的表達(dá) 小結(jié):本研究利用化學(xué)合成的21nt的AMPKα2siRNA，通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，利用反向轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入HepG2細(xì)胞24h后，AMPKα2mRNA及蛋白表達(dá)抑制率分別為52.3±0.8％及48.1±2.3％，可有效地降解AMPKα2mRNA并抑制其蛋白表達(dá)，這一作用持續(xù)72小時(shí)以上，為進(jìn)一步研究人抵抗素是否通過AMPK通路影響HepG2細(xì)胞的糖脂代謝打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分抵抗素

9、對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖代謝的影響及其與AMPK通路的關(guān)系 目的:探討人抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖代謝影響及其與AMPK通路的關(guān)系。 小結(jié)：　　1.人抵抗素在基礎(chǔ)狀態(tài)下以劑量依賴方式降低HepG2細(xì)胞AMPK磷酸化水平，在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下降低AMPKα2 mRNA的表達(dá)及AMPK磷酸化水平；應(yīng)用AMPKα2 siRNA可使AMPKα2 mRNA的表達(dá)及AMPK磷酸化水平進(jìn)一步降低?！　?.人抵抗素可影響HepG

10、2細(xì)胞的葡萄糖代謝：下調(diào)HepG2細(xì)胞GLUT—2 mRNA的表達(dá)，上調(diào)糖異生關(guān)鍵酶G6Pase、PEPCK mRNA表達(dá)，并使肝糖原合成減少?！　?.人抵抗素可通過AMPK通路影響HepG2細(xì)胞葡萄糖代謝。 第三部分抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響及其與AMPK通路的關(guān)系 目的:探討人抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞脂肪代謝影響及其與AMPK通路的關(guān)系。 小結(jié)：　　1.在高濃度的游離飽和脂肪酸環(huán)境中，在基礎(chǔ)及胰島

11、素刺激狀態(tài)下人抵抗素可降低HepG2細(xì)胞AMPKα2 mRNA的表達(dá)及AMPK磷酸化水平；應(yīng)用AMPKα2siRNA可使AMPKα2 mRNA的表達(dá)及AMPK磷酸化水平進(jìn)一步降低。　　2.人抵抗素可影響HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)代謝：增加胞膜脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36含量，上調(diào)ACC2、SREBP1 mRNA的表達(dá)以及降低ACC1(Ser79)蛋白磷酸化水平，使ACC活性增加，下調(diào)肝脂肪酶HL mRNA的表達(dá)，并使HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪含量增加。

12、　　3.人抵抗素可通過AMPK通路影響HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝。 第四部分抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的影響 目的:探討人抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素PI3K/Akt信號(hào)通路的影響及PI3K/Akt通路與AMPK通路與之間的關(guān)系。 小結(jié)：　　1.人抵抗素上調(diào)HepG2細(xì)胞SOCS—3 mRNA表達(dá)，下調(diào)IRS—2 mRNA表達(dá)、減低Akt的蛋白量及降低Akt磷酸化水平。人抵抗素對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素PI