不同結(jié)構(gòu)形式的HBx蛋白對其在肝癌細(xì)胞HepG2中分布的影響.pdf

1、目的：目的：HCC是一種全世界普遍的惡性腫瘤，經(jīng)常被診斷出來時已到晚期，病死率高。目前的流行病學(xué)資料表明肝癌的發(fā)生率不斷攀升，在接下來的十年中，不僅僅是亞洲，非洲，而且北美和歐洲的肝癌發(fā)生率也將會逐年增加。由于其對目前的化療藥物耐藥，大多數(shù)患者都得不到有效治療，其它的治療方法例如切除，移植或經(jīng)皮和動脈介入療法其療效都是極其有限。肝癌的危險因子主要包括：HBV，HCV，AFB1，化學(xué)致癌物—二乙基亞硝胺，酒精等。在中國，HBV感染是肝細(xì)胞

2、癌（HCC）發(fā)生的主要危險因子，并且由其編碼的HBx蛋白被認(rèn)為介導(dǎo)了肝細(xì)胞的癌變。HBx蛋白能夠引發(fā)肝癌發(fā)生發(fā)展的一個潛在的機(jī)制，可能涉及到其細(xì)胞內(nèi)的分布。本研究選用不同的真核表達(dá)載體，分別克隆并構(gòu)建了包含HBX基因或其與GFP以不同方式融合表達(dá)的重組質(zhì)粒，探究不同結(jié)構(gòu)形式的HBX蛋白對其在肝癌細(xì)胞內(nèi)定位和分布的影響。
　　方法：
　　1以本實驗室保存的的pcDNA3.0-HBX質(zhì)粒為摸板，采用PCR方法擴(kuò)增出Flag-HB

3、X片段，克隆至pMD-18T載體中，測序正確后，分別亞克隆至不同真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFlag-HBX-IRES2-EGFP，pEGFP-C3-Flag-HBX，pFlag-HBX-EGFP-N3。
　　2．將成功構(gòu)建的三種真核重組表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，通過間接免疫熒光染色顯示HBx蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位和分布，在CHKOlympus倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，應(yīng)用AdobePhotoshop7.0和ImageJ兩個

4、圖像處理軟件對照片進(jìn)行處理。
　　結(jié)果：
　　1.三種真核重組質(zhì)粒經(jīng)測序，PCR和雙酶切鑒定驗證其含有HBX片段。
　　2.不同結(jié)構(gòu)形式的HBx蛋白影響了其在肝癌細(xì)胞HepG2中的分布和表達(dá)水平。構(gòu)建的pFlag-HBX-IRES2-EGFP質(zhì)粒能分別表達(dá)HBx和GFP蛋白，并觀察到GFP蛋白在整個HepG2細(xì)胞中是均勻分布的，然而HBx蛋白主要是呈顆粒狀分布在細(xì)胞核周圍。在pEGFP-C3-HBX-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組

5、中，GFP-HBX融合蛋白主要分布在核周圍，呈粗顆粒狀，核內(nèi)有少許分布。在pEGFP-C3-HBX-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，HBX-GFP融合蛋白基本上是均勻分布在整個HepG2細(xì)胞中，與以上兩組明顯不同。相似的是，在核周也有一些散在的顆粒存在，其數(shù)量在三組中居中。
　　結(jié)論：
　　1.為研究HBx蛋白在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了有意義的實驗依據(jù)，尤其是對體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果的解釋提供了借鑒。
　　2.病理組織中HBx蛋白的