下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)肽Y對高脂飲食大鼠肝臟胰島素敏感性的影響.pdf

1、背景：正常情況下機(jī)體通過調(diào)控能量攝入和輸出平衡來維持機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)。長期能量攝入超出能量輸出將導(dǎo)致過多的能量以脂質(zhì)的形式儲存于脂肪中，最終導(dǎo)致機(jī)體肥胖的發(fā)生。我國目前擁有超重者至少2-3億，其中肥胖患者2000-3000萬，這將為我國造成極大的經(jīng)濟(jì)社會負(fù)擔(dān)。因此，能夠提高肥胖及其相關(guān)疾病預(yù)防和改進(jìn)相關(guān)治療措施是目前迫切需要解決的問題之一。中樞系統(tǒng)中的下丘腦在維持能量的平衡起著重要作用。下丘腦的核團(tuán)有弓狀核(arcuate，ARC)、背內(nèi)側(cè)

2、核(dorsomedial hypothalamus，DMH)、室旁核(paraventricularnucleus，PVN)、下丘腦外部(1ateral hypothalamus，LH)和腹正中核(ventromedial nucleus，VMN)，這些不同核團(tuán)在能量平衡的維持中發(fā)揮著不同的作用。神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y,NPY）是下丘腦中所產(chǎn)生的一種重要的促進(jìn)食欲的肽，在下丘腦中，NPY主要由ARC和DMH表達(dá)產(chǎn)生，相

3、關(guān)研究已經(jīng)證明ARC和DMH中的NPY均在控制能量的平衡中發(fā)揮著重要作用，DMH中的NPY不僅能逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖的發(fā)生，并且在腹股溝白色脂肪棕色化和維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。肥胖能引起機(jī)體出現(xiàn)高胰島素血癥和外周器官胰島素抵抗的發(fā)生。相關(guān)研究證實下丘腦DMH NPY基因的敲除會改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖的發(fā)生，但下丘腦DMH NPY是否會通過對肥胖引起肝臟胰島素敏感性的影響來調(diào)節(jié)機(jī)體葡萄糖的穩(wěn)態(tài)還不清楚。本文主要研究下丘腦DM

4、H NPY表達(dá)下調(diào)對高脂飲食大鼠肝臟胰島素敏感性的影響。通過對DMH NPY的研究或許為未來肥胖新的治療方法提供有力的證據(jù)。
　　目的：利用病毒載體建立大鼠下丘腦DMH NPY表達(dá)下調(diào)模型，同時應(yīng)用高脂飼料誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生肥胖；探討下丘腦DMH NPY對高脂飲食大鼠體重、血糖、胰島素水平、甘油三酯、總膽固醇、胰島素抵抗指數(shù)和胰島素敏感指數(shù)的影響及胰島素相關(guān)信號通路中的胰島素受體底物1、磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B、磷酸化的蛋白激酶B

5、和葡萄糖合成激酶3的影響；肝臟蘇木精-伊紅染色法觀察肝臟病理形態(tài)的變化。
　　方法：病毒載體由試劑公司合成組裝，AAVshNPY為攜帶NPY基因表達(dá)下調(diào)的病毒載體，AAVshCTL為攜帶空載體的病毒。根據(jù)Paxinos和Watson的大鼠腦圖譜,確定DMH核團(tuán)三維坐標(biāo)，其坐標(biāo)為：前囟后2.3mm，矢狀縫兩側(cè)0.4mm，顱骨表面下7.6mm。雄性SD大鼠(Sprague Dawley rat)體重為130-160g適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，

6、隨機(jī)分為2組，一組給予雙側(cè)DMH注射AAVshNPY，另外一組給予雙側(cè)DMH注射AAVshCTL，注射量為0.5ul每邊（1*109 particles/site），以0.1ul/min的速度注入，5min注射完畢，注入后在原位置停留5min。病毒注入后，給予基礎(chǔ)飼料（normal control diet，NC）喂養(yǎng)4周后每組再隨機(jī)分為高脂飼料（high fat diet，HF）組和NC組；實驗期間，各組大鼠均自由攝食及飲水，溫度控制

7、在（22±2）℃，相對濕度為（50±10）％，明暗周期為12h/12h。每天記錄進(jìn)食量和飲水量，并每周測定大鼠體重。病毒注射1、2周后，分別隨機(jī)取AAVshNPY組大鼠處死5只然后取腦，4周后處死AAVshCTL和AAVshNPY各組5只取腦，檢測病毒注入情況；16周末隔夜禁食后稱體重，尾靜脈測血糖，斷頭處死大鼠取血，離心后-20℃保存，迅速分離肝臟組織及鼠腦組織一部分置于液氮保存待測，一部分放于多聚甲醛中以做石蠟包塊。酶聯(lián)免疫吸附測定

8、法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測測定血清胰島素（insulin，INS）、血清總膽固醇（Total cholesterol，TC）和甘油三酯（Triglyceride，TG）的水平，并根據(jù)血糖值和血清INS水平計算胰島素抵抗指數(shù)（Homeostasis model assessment-Insulin resistance，HOMA-IR）（HOMA-IR=空腹血糖（FBG,mmo

9、l/L）×空腹血清胰島素（FINS,mU/L）/22.5）和胰島素敏感指數(shù)(Insulin sensitive index，ISI)（ISI=1/(FBG×FINS)），qRT-PCR法檢測肝臟組織胰島素受體底物1（Insulin receptor substrate1，IRS-1）、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)的mRNA表達(dá)水平，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）

10、檢測胰島素信號通路中蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)、磷酸化的蛋白激酶B（Phosphorylated protein kinase B,p-Akt）和葡萄糖合成激酶3（Glycogen Synthase Kinase3，GSK3）蛋白的表達(dá)。肝臟蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE)觀察肝臟病理形態(tài)的改變。
　　結(jié)果：⑴與NC組比，HF組的GLU值、血清INS、TC

11、、TG水平和HOMA-IR均出現(xiàn)明顯的升高（P<0.05），而ISI出現(xiàn)了降低（P<0.05），IRS-1和PI3K的mRNA水平在HF組出現(xiàn)了明顯的降低（P<0.05），GSK3、p-Akt蛋白表達(dá)水平在HF組出現(xiàn)了下降（P<0.05）；肝臟組織HE染色HF組出現(xiàn)了脂肪變性；而Akt的蛋白表達(dá)水平在各組無明顯變化（P>0.05）。⑵與AAVshCTL組相比，AAVshNPY組的GLU值、血清INS、TC、TG水平和HOMA-IR均出現(xiàn)