下丘腦室旁核神經(jīng)肽Y長期過表達誘導(dǎo)外周胰島素抵抗作用機制研究.pdf

1、1.背景與目的:
　　研究揭示NPY發(fā)揮生物學(xué)活性是通過與其結(jié)合的細胞膜上跨膜結(jié)構(gòu)G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的，這些受體有NPYY1，Y2，Y3和Y5受體。這些受體廣泛表達于代謝相關(guān)的組織中，如脂肪組織和肝臟。有證據(jù)表明NPY主要通過Y1和Y5受體影響外周組織代謝功能。那么，NPY是否通過Y1和/或Y5受體參與外周脂肪組織胰島素抵抗，其具體作用機制尚需進一步研究。
　　本研究采用高脂飲食(high fat diet，HFD)以及HF

2、D聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射，建立了肥胖以及糖尿病模型，觀察其下丘腦NPY表達以及脂肪組織PI3K/Akt/GSK3信號通路的變化。通過下丘腦PVN原位注射重組慢病毒載體構(gòu)建NPY基因過表達大鼠動物模型，觀察大鼠外周組織是否發(fā)生胰島素抵抗，探究可能參與的信號級聯(lián)機制。離體實驗觀察NPY對胰島素刺激的3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗及攝取的影響，結(jié)合NPY Y1和Y5受體特異性拮抗劑進一步揭示NPY誘導(dǎo)脂

3、肪細胞代謝紊亂的分子生物學(xué)機制。旨在明確中樞NPY與外周脂肪組織胰島素抵抗的關(guān)系，為使用NPY受體特異性拮抗劑改善由中樞NPY介導(dǎo)代謝紊亂提供藥理學(xué)依據(jù)。
　　2.方法:
　　2.1肥胖及糖尿病大鼠NPY表達及PI3K/Akt/GSK3信號通路測定
　　大鼠HFD10周，加用或不加STZ腹腔注射建立肥胖及糖尿病大鼠模型(HFD，HFD+STZ組)。4周后，以空腹血糖值≥16.7 mmol/L作為糖尿病模型建模成功標準。

4、在干預(yù)前及干預(yù)后，進行體重（body wight，BW）、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、血漿甘油三脂(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，CHO)、血清胰島素(fasting insulinlevels，F(xiàn)INS)、lee氏指數(shù)以及穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model of assessmentfor insulin resistence index，

5、HOMA-IR)等指標的測定。采用免疫熒光檢測PVN中NPY和可卡因-苯丙胺轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)肽(cocaine-and amphetamine regulated transcript，CART)的表達，Western-blotting測定脂肪組織PI3K/Akt/GSK3信號通路以及NPYY5受體表達變化。
　　2.2觀察慢病毒對下丘腦PVN神經(jīng)細胞的穩(wěn)定感染
　　向大鼠PVN內(nèi)精確注射攜帶綠色熒光蛋白(green fluores

6、cent protein，GFP)熒光標記的慢病毒顆粒，分別在病毒注射后1周、2周及4周，使用激光共聚焦觀察大鼠腦內(nèi)慢病毒注射位置、病毒顆粒感染以及熒光蛋白表達情況。
　　2.3分析PVN內(nèi)NPY與大鼠外周胰島素抵抗的關(guān)系并探討其機制
　　構(gòu)建重組NPY熒光慢病毒顆粒，并使用該病毒進行大鼠PVN核團原位注射，結(jié)合HFD干預(yù)8周。觀察慢病毒顆粒局部感染及NPY蛋白過表達水平，檢測HFD及NPY過表達對大鼠體重、體溫、每日攝食量

7、、TG、CHO、脂肪組織相對重量、Lee氏指數(shù)的影響。通過測定大鼠FBG、FINS、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin A1c，HbA1c)、葡萄糖鉗夾實驗葡萄糖平均輸注率(glucose infusion rate，GIR)、HOMA-IR、靜脈葡萄糖耐量實驗(intravenous glucose tolerance test，IVGTT)以及組織葡萄糖利用指數(shù)(glucose utilization index，

8、Rg)評估是否存在脂肪組織胰島素抵抗。并使用Western-blotting測定脂肪組織PI3K/Akt/GSK3信號通路以及NPYY5受體表達變化。
　　3.結(jié)果:
　　3.1肥胖及糖尿病大鼠PVN內(nèi)NPY蛋白表達增加
　　HFD大鼠BW、FBG、CHO、TC及FINS水平明顯高于LFD。Lee氏指數(shù)結(jié)果顯示HFD誘導(dǎo)大鼠肥胖模型成立。HFD及HFD聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病建模均可明顯升高大鼠HOMA-IR，提示大鼠存在

9、一定程度的胰島素抵抗。免疫組化結(jié)果表明，PVN內(nèi)NPY和CART存在一定程度的共表達，肥胖大鼠下丘腦神經(jīng)細胞內(nèi)NPY和CART蛋白表達水平明顯高于低脂飲食(low fat diet，LFD)組，在此基礎(chǔ)上，糖尿病大鼠較單純肥胖大鼠下丘腦NPY和CART蛋白表達水平進一步增加。盡管肥胖及糖尿病大鼠NPY和CART蛋白表達水平均顯著升高，但以NPY蛋白表達增加為主。
　　3.2慢病毒顆粒原位長期穩(wěn)定感染
　　外源性注射含GFP的

10、慢病毒載體顆?？筛腥旧窠?jīng)細胞，GFP廣泛表達于神經(jīng)細胞胞漿中，并在神經(jīng)樹突、軸突中均有分布，神經(jīng)細胞之間突觸聯(lián)系緊密，形成復(fù)雜而精細的神經(jīng)3D網(wǎng)絡(luò)。分別對病毒注射后1、2、4周的大鼠大腦進行解剖發(fā)現(xiàn)，GFP表達穩(wěn)定且持久，即使在注射病毒后4周仍可見明顯的GFP蛋白在PVN局部高表達。
　　3.3 NPY過表達誘導(dǎo)大鼠外周胰島素抵抗
　　3.3.1 PVN局部NPY持續(xù)高表達
　　注射慢病毒8周后，檢測大鼠PVN熒光蛋白

11、表達情況發(fā)現(xiàn):1、無論是熒光標記蛋白(Cherry)或是NPY蛋白在PVN核團均有明顯的表達，且NPY和Cherry表達具有共定位。2、無論是LFD或是HFD組，重組NPY慢病毒注射入大鼠PVN均可使局部NPY蛋白表達明顯增加。這些結(jié)果表明，本研究成功地將慢病毒準確注射進入PVN，并使其局部持續(xù)高表達8周。
　　3.3.2 NPY過表達誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗
　　正常血糖-高胰島素鉗夾實驗結(jié)果顯示HFD、LFD+NPY和HFD+

12、NPY組GIR60-120明顯低于LFD，提示無論HFD或PVN局部長期過量表達NPY均可誘導(dǎo)外周胰島素抵抗。然而，本研究并未觀察到NPY對血漿葡萄糖水平的影響。靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)檢測發(fā)現(xiàn)，與LFD組相比，HFD、LFD+NPY和HFD+NPY組血漿胰島素曲線下面積顯著升高，這一變化趨勢與葡萄糖鉗夾實驗結(jié)果一致，均提示HFD和NPY持續(xù)過表達誘導(dǎo)外周組織胰島素抵抗。此外，HOMA-IR結(jié)果也證實了這一點。
　　3.3

13、.3 NPY過表達誘導(dǎo)肥胖和脂肪組織胰島素抵抗
　　HFD、LFD+NPY和HFD+NPY組體重明顯大于LFD組，尤其是在實驗后期。值得注意的是， LFD+NPY和HFD+NPY組大鼠每日攝食量在實驗最初階段（前三周）明顯高于LFD和HFD組，但在實驗第4周NPY誘導(dǎo)進食增加的作用不再明顯，NPY過表達兩組大鼠每日進食量與其余兩組無明顯差異。NPY過表達未能顯著改變血糖化血紅蛋白、甘油三酯和膽固醇水平，但HFD卻增加了三者的血漿水

14、平。這一發(fā)現(xiàn)與HFD增加空腹血糖水平一致。另一方面，HFD和PVN內(nèi)NPY過表達使得大鼠脂肪組織相對重量（總脂肪組織/體重）明顯增加，這與lee氏指數(shù)結(jié)果一致，均表明高脂和NPY過表達導(dǎo)致肥胖。上述研究結(jié)果表明，HFD和NPY過表達均可引起肥胖，但后者并不增加血漿葡萄糖、糖化血紅蛋白及血脂水平。本研究還檢測了組織葡萄糖利用指數(shù)（Rg')用于評估不同組織對葡萄糖攝取的影響。結(jié)果表明，HFD、LFD+NPY和HFD+NPY組脂肪組織2-[3

15、H] DG攝取明顯降低，而各組肌肉組織2-[3H] DG攝取明顯差異。
　　4.結(jié)論:
　　4.1 HFD誘導(dǎo)的肥胖模型以及HFD聯(lián)合STZ注射誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型均存在胰島素抵抗。PVN內(nèi)NPY和CART存在一定程度的共表達，肥胖大鼠PVN內(nèi)NPY和CART蛋白表達明顯增加，在此基礎(chǔ)上，糖尿病大鼠PVN內(nèi)NPY和CART蛋白表達進一步增加，且以NPY蛋白增加為主。
　　4.2外源性注射含GFP慢病毒載體顆?？捎行Ц腥?/p>

16、神經(jīng)細胞，GFP廣泛表達于神經(jīng)細胞胞漿中。GFP表達穩(wěn)定且持久，即使在注射病毒后4周仍可見明顯的GFP蛋白在PVN局部高表達。
　　4.3 PVN局部NPY長期過表達促進飲食短暫性增加，并誘導(dǎo)外周脂肪組織胰島素抵抗，但并不改變血糖、糖化血紅蛋白及血脂水平。此外，NPY過表達可明顯降低大鼠脂肪組織GSK3β、PI3Kp85及Akt磷酸化水平，同時增加Y5 R受體表達。
　　4.4 NPY可明顯抑制胰島素刺激的葡萄糖消耗及攝取，