下丘腦背內側核神經肽Y表達缺失對大鼠脂肪組織脂代謝的影響研究.pdf

1、背景：肥胖及肥胖相關性疾病嚴重威脅著人類健康，已成為全世界亟待解決的課題。人類和哺乳動物體內，白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）主要司儲存能量，棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）增強非戰(zhàn)栗性產熱、增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗。成年嚙齒類動物體內肩胛間區(qū)存在棕色脂肪組織，而腹股溝區(qū)、附睪、內臟脂肪組織則為白色脂肪組織。在一定干預條件下，白色脂肪組織可以發(fā)生棕色樣改變。PR結構

2、域家族的第16個成員PRDM16（PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain containing16）是BAT中高表達的一種轉錄調節(jié)因子，在棕色脂肪細胞分化過程中起正向調節(jié)作用，參與誘導細胞線粒體數量增多和功能增強，增強線粒體氧化磷酸化，加速能量消耗和熱量生成。Ⅱ型脫碘酶（TypeⅡiodothyronine deiodinase，Dio-2）是棕色脂肪組織的分子標志之一，在棕色脂肪細胞可通過與解偶聯蛋白1（unc

3、oupling protein1，UCP1)的基因特異位點結合啟動轉錄，促進能量代謝。下丘腦在維持能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。神經肽Y（neuropeptide Y，NPY）是一種重要的促食欲肽，對攝食的調節(jié)多依賴于下丘腦中的NPY神經元，在下丘腦，NPY存在于弓狀核、背內側核等區(qū)域，以弓狀核含量最豐富。研究顯示，特異性敲除高脂飲食誘導的肥胖大鼠下丘腦弓狀核NPY基因可改善肥胖大鼠的能量代謝。成纖維細胞生長因子-21（fibroblast

4、growth factor-21，FGF21）可表達于肝臟、脂肪組織和胰腺等器官和組織（嚙齒類動物），通過形成 FGF21/?-Klotho/FGFR復合體發(fā)揮多種生物學效應，改善糖脂代謝。FGF21經交感神經系統(tǒng)誘導WAT中出現米色或棕色脂肪細胞。而下丘腦背內側核神經肽 Y表達缺失與脂肪組織內脂代謝相關基因的表達水平（如 PRDM16、Dio-2、FGF21）的關系，尚未見明確報道。
　　目的：建立下丘腦背內側核神經肽Y表達缺失

5、的大鼠動物模型，并給予高脂飲食干預，探討大鼠的體重改變和脂肪組織脂代謝相關基因PRDM16、Dio-2和FGF21表達變化。
　　方法：建立動物模型：4-5周齡雄性清潔級SD大鼠80只，其中體重為270-300g的大鼠20只，體重為130-150g的大鼠60只。適應性喂養(yǎng)1周后，構建腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）介導的帶有熒光標記的RNAi（RNA interference）重組轉運體（AAVs

6、hNPY及 AAVshCTL），病毒滴度為1×109 particles/site。其中AAVshNPY導致表達缺失，AAVshCTL是作為對照的空載體。用270-300g的大鼠驗證建模是否成功，根據Paxinos和Watson大鼠腦圖譜定位DMH的位置。隨機選取15只分別接受雙側DMH的AAVshNPY注射，并在注射病毒的1、2和4周后（每周隨機選取5只）處死，再隨機選取5只分別接受雙側DMH的AAVshCTL注射，注射4周后處死。處

7、死后迅速取下丘腦，一部分置于液氮中保存，制作冰凍切片觀察轉染位置，一部分制作石蠟切片應用熒光原位雜交技術檢測DMH NPY mRNA的表達，確定病毒重組體能夠敲除DMH NPY即建模成功；將余60只大鼠隨機均分為兩組，根據Paxinos和Watson大鼠腦圖譜定位 DMH的位置。上述兩組分別接受雙側 DMH的AAVshNPY（AAVshNPY組）及AAVshCTL空載體（AAVshCTL組）注射，完成動物模型的建立。每周1次于固定時間對

8、各組大鼠進行稱重并記錄。實驗1～4周所有大鼠給予常規(guī)飲食（regular chow，RC），第5周再從AAVshNPY組及AAVshCTL組各自隨機選取一半大鼠給予高脂飲食（high fat diet，HF），其余大鼠仍給予常規(guī)飲食，此時所有大鼠被分為AAVshNPY HF組、AAVshNPYRC組、AAVshCTL HF組、AAVshCTL RC組。注射病毒16周后處死大鼠，采集腹股溝區(qū)和附睪脂肪組織，液氮保存。實時熒光定量PCR（R

9、eal time PCR）法測定大鼠腹股溝區(qū)和附睪脂肪組織FGF21mRNA、PRDM16mRNA、Dio-2 mRNA的表達。蛋白質印跡法（Western blot，WB）測定大鼠腹股溝區(qū)和附睪脂肪組織中PRDM16蛋白表達水平。
　　結果：⑴攜帶紅色熒光的病毒成功注入下丘腦背內側核，注射后，AAVshNPY組的NPY mRNA表達水平低于AAVshCTL組，分別將注射1、2、4周后AAVshNPY組與AAVshCTL組比較，均

10、有顯著差異（P?0.05）。⑵第5周添加高脂飲食前AAVshNPY組與AAVshCTL組比較，有顯著差異（P?0.05），提示DMH NPY缺失已開始導致體重增速減緩；第16周末：與常規(guī)飲食組大鼠相比，高脂飲食組大鼠體重增加顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P?0.01），提示高脂飲食誘導大鼠體重增長迅速；與AAVshCTL組相比，AAVshNPY組體重增長量明顯較低，有顯著差異（P?0.01），提示DMH NPY缺失可引起體重增長緩慢。⑶腹股溝

11、區(qū)和附睪脂肪組織FGF21mRNA的表達均呈現以下特征：AAVshCTL組與AAVshNPY組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P0.05），提示DMH NPY敲除對脂肪組織FGF21表達無影響；與RC組相比，HF組大鼠均呈現低表達，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01），提示高脂飲食降低脂肪組織FGF21的表達。各組大鼠附睪脂肪組織中PRDM16和Dio-2 mRNA的表達水平均較低，兩者的組間兩兩比較提示差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。提示DMH N

12、PY表達缺失和高脂飲食對附睪脂肪組織PRDM16、Dio-2 mRNA的表達均無影響。腹股溝區(qū)脂肪組織PRDM16和Dio-2 mRNA的表達一致，如下：與AAVshCTL相比，AAVshNPY組的表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01），提示DMH NPY敲除引起PRDM16和Dio-2 mRNA高表達；與RC組相比，HF組表達水平下調，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01），提示高脂飲食誘導PRDM16和Dio-2 mRNA表達下降

13、。⑷與AAVshCTL高脂飲食組相比，AAVshNPY高脂飲食組腹股溝區(qū)脂肪組織PRDM16蛋白高表達，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）；與AAVshCTL常規(guī)飲食組相比，AAVshCTL高脂飲食組腹股溝區(qū)脂肪組織PRDM16蛋白低表達，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。而附睪脂肪組織中，組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P?0.05）。與RT-PCR檢測結果一致。
　　結論：①下丘腦背內側核神經肽Y表達缺失能上調大鼠腹股溝區(qū)脂肪組織棕色脂