下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DMH)中TRPV4對寒冷刺激引起的大鼠戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、前言:
   瞬時感受器電位(transientreceptorpotential,TRP)是近年來研究發(fā)現(xiàn)的與感覺功能有關(guān)的膜通道蛋白家族,在哺乳類動物,TRRP家族可分為6個亞家族,包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP及TRPML。TRPV4(又稱OTRPC4)是TRPV家族成員之一,是一種由871個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。在人類,其基因定位于12q24.1。NiliusB等研究表明,TRPV4在哺乳動物組織中,

2、主要存在于心臟,大腦,內(nèi)皮,腎,感覺神經(jīng)元,交感神經(jīng),脂肪組織,腸,唾液腺,肺,皮膚,汗腺,內(nèi)耳和角質(zhì)形成細胞。原位雜交實驗顯示,在小鼠大腦TRPV4的表達部位在大腦的終板層,終板血管器的神經(jīng)元,視交叉,腹側(cè)的海馬聯(lián)合,下丘腦,側(cè)腦室脈絡(luò)叢的室管膜細胞和脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglia,DRG)神經(jīng)元中。
   TRPV4是一個非選擇性陽離子通道,激活時可產(chǎn)生較強的鈣離子內(nèi)流。2002年,Guler等用TRPV

3、4cDNA轉(zhuǎn)染非洲爪蟾卵母細胞(Xenopusoocyte)和人胚腎293細胞(humanembryonickidneyHEK293cell),研究發(fā)現(xiàn)TRPV4可感受低滲透壓刺激,并具有溫控特性,可被27℃以上的溫熱刺激激活。TRPV4對溫熱刺激的反應也可被釘紅抑制。
   恒溫動物正常體溫的維持是在體溫調(diào)節(jié)機制的調(diào)控下,產(chǎn)熱和散熱過程處于平衡。在寒冷刺激下,機體可通過戰(zhàn)栗產(chǎn)熱和非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱維持體熱平衡。非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱又稱代謝產(chǎn)熱,

4、主要有棕色脂肪組織和骨骼肌的非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱兩種形式。戰(zhàn)栗樣肌肉收縮是指在寒冷環(huán)境中,骨骼肌發(fā)生的不隨意的節(jié)律性收縮,其節(jié)律為9-11次/分。發(fā)生戰(zhàn)栗的肌肉在肌電圖上表現(xiàn)出成簇的高波幅集群放電,這是許多肌纖維同步化放電的結(jié)果。戰(zhàn)栗的特點是屈肌和伸肌同時收縮,所以不對外做功,產(chǎn)熱量很高。驅(qū)動戰(zhàn)栗反應的中樞在下丘腦背內(nèi)側(cè)核,該中樞發(fā)出的沖動經(jīng)腦干脊髓外側(cè)束,下達到脊髓前角運動神經(jīng)元。這些沖動能增加肌緊張,肌緊張一旦超過臨界水平,引起肌纖維收縮,就

5、出現(xiàn)具有明顯戰(zhàn)栗特征的節(jié)律性震顫。震顫速率可達10-20次/秒,其效率可在數(shù)秒到數(shù)分鐘內(nèi)使產(chǎn)熱提高許多倍。
   KojiShibasaki等研究證明,在海馬神經(jīng)元中存在的TRPV4通過影響其神經(jīng)元靜息電位水平,調(diào)控海馬神經(jīng)元的興奮性,進而影響海馬神經(jīng)元的功能活動。本實驗室以往的研究提示,下丘腦中的TRPV4參與維持正常體溫和LPS致大鼠發(fā)熱過程。因此推測下丘腦背內(nèi)側(cè)核中的TRPV4可能參與調(diào)控在寒冷刺激下引起的戰(zhàn)栗產(chǎn)熱。

6、>   本實驗旨在探討下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DMH)中TRPV4參與體溫調(diào)節(jié)的中樞機制。應用寒冷刺激下大鼠戰(zhàn)栗產(chǎn)熱的模型,結(jié)合在DMH給予TRPV4特異性激動劑4-α-佛波醇-12,13-二葵酸(4-α-phorbol-12,13-didecanoate,4αPDD)或拮抗劑釕紅(rutheniumred),觀察在所設(shè)定的寒冷條件下動物體溫的實時變動情況,DMH中TRPV4表達量和細胞內(nèi)鈣含量,同時檢測發(fā)生戰(zhàn)栗時骨骼肌的肌電反應強度。

7、>   方法:
   1、實驗動物及處理
   (1)實驗動物及分組
   選用健康雄性SD大鼠72只,體重220~250g,基礎(chǔ)體溫(38.1±0.2)℃,由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。將動物隨機分為6組,每組12只:正常對照組(N)、單純冷暴露組(C)、4aPDD組(P)、4aPDD+冷暴露組(P+C)、釕紅組(R)、釕紅+冷暴露組(R+C)。
   (2)大鼠DMH部位插管和發(fā)射子植入
 

8、  下丘腦DMH插管:將大鼠用10%水合氯醛按每公斤體重3毫升腹腔麻醉,將其頭部固定于立體定位儀,切開皮膚,暴露出前囟。參照大鼠腦圖譜,向下丘腦DMH(B:-3.3mm,L/R:0.5mm,H:9mm),插入不銹鋼管,并留置與其相匹配的針芯,用牙托水加牙科水泥固定。
   檢測插管位置:試驗結(jié)束后,向DMH中微量注射液體染料亞甲藍1微升。隨后用多聚甲醛經(jīng)大鼠心臟灌流,取出經(jīng)固定的大腦,并經(jīng)過30%蔗糖溶液中脫水后,制備冰凍切片

9、,顯微鏡下觀察插管位置,參照大鼠腦圖譜確定插管位置。
   無線遙感體溫發(fā)射子及肌電發(fā)射子植入:在麻醉狀態(tài)下,大鼠腹腔植入無線遙感系統(tǒng)發(fā)射子,并將金屬探頭埋入大鼠骨骼肌中。術(shù)后動物單籠飼養(yǎng),恢復一周后進行實驗。
   2、體溫測量
   應用BW-200生理無線遙測系統(tǒng)對大鼠體溫進行測量。正式實驗前一日早上8時開始記錄大鼠基礎(chǔ)體溫,每隔30分鐘測量體溫1次,共測量6小時,取其平均值記為基礎(chǔ)體溫。實驗均在早8時開始

10、,各組在相應處理后開始監(jiān)測體溫變化,每隔5分鐘自動記錄體溫一次,直至實驗結(jié)束。
   3、肌電測量
   應用BW-200生理無線遙測系統(tǒng)測量大鼠骨骼肌肌電強度。
   4、下丘腦DMH細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)測定
   采用日立F-4500型熒光雙波長分光光度計測定。
   5、下丘腦DMH中TRPV4表達測定
   (1)Westernblot方法檢測下丘腦DMH中TRPV4

11、表達。對照選用抗β-肌動蛋白抗體(β-actin)。目的蛋白與相應β-actin蛋白的灰度比值作為該目的蛋白的相對表達量。
   (2)免疫熒光檢測:DMH中TRPV4的表達,并在熒光顯微鏡下觀察、攝片。
   6、數(shù)據(jù)分析
   所有實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)士標準差(x±s)表示,應用t檢驗比較各組均數(shù)間的差異,相關(guān)分析用相關(guān)性檢驗分析法。
   結(jié)果:
   1.與對照組(N)比較,單純冷暴露組(C)

12、的體溫明顯下降;肌電的幅度降低;DMH中TRPV4表達增加,細胞內(nèi)鈣離子濃度升高。
   2.與單純冷暴露組(C)比較,預先給予4aPDD后進行冷暴露(P+C),體溫明顯下降;肌電的強度降低;DMH中TRPV4蛋白表達、細胞內(nèi)鈣離子濃度高于C組。
   3.與單純冷暴露組(C)比較,預先給予釕紅后進行冷暴露(R+C),體溫與N組比較無明顯差別,但明顯高于C組;肌電的幅度也高于C組;DMH中TRPV4蛋白表達、細胞內(nèi)鈣離子

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