TRPV4對(duì)大鼠HSC-T6細(xì)胞的作用探究.pdf

1、肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是肝臟對(duì)酒精、藥物、病毒感染、自身免疫失衡等細(xì)胞損傷因素而產(chǎn)生的一種可逆的愈合反應(yīng)，為慢性肝病共有的病理改變，主要表現(xiàn)為以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)大量沉積并伴有肝臟損傷，如果不加以控制，肝纖維化可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。探討肝纖維化形成過(guò)程中的機(jī)制對(duì)慢性肝病的治療具有重要的意義。
　　肝星狀細(xì)胞(Hepatic

2、stellate cells，HSCs)與肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程存在著密切的聯(lián)系，HSCs細(xì)胞的激活對(duì)肝纖維化的形成有著重要的作用。激活的HSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)化形為肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast-like cells，MFBLC)，并分泌大量的膠原，最終導(dǎo)致肝纖維的形成。作為肝纖維化發(fā)生的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，促進(jìn)增殖的HSCs發(fā)生凋亡已成為防治肝纖維化有效途徑。大量研究證實(shí)，自噬(Autophagy)在肝纖維化形成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用

3、，自噬與HSCs細(xì)胞的凋亡也存在密切的聯(lián)系。同時(shí)，研究表明，HSCs細(xì)胞的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞鈣離子(Ca2+)內(nèi)流，抑制HSCs細(xì)胞Ca2+內(nèi)流對(duì)促進(jìn)活化的HSCs細(xì)胞發(fā)生凋亡具有重要的意義。并且，研究證實(shí)Ca2+濃度的變化對(duì)細(xì)胞自噬也起著重要的調(diào)節(jié)作用。課題組前期研究證實(shí)，非選擇性Ca2+瞬時(shí)感受器電位離子通道香草素受體亞家族4(Transient receptor potential vanilloid receptor4，TRPV4

4、)在肝纖維化形成中發(fā)揮著重要的作用。本課題重點(diǎn)研究TRPV4對(duì)大鼠HSC-T6的作用，為肝纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　主要研究?jī)?nèi)容概括如下：
　　1. TRPV4在大鼠肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)情況及對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡蛋白的影響
　　實(shí)驗(yàn)采用大鼠HSC-T6細(xì)胞系為研究對(duì)象，用濃度為10ng/ml TGF-β1處理細(xì)胞24h，實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)、Western blot檢測(cè)TRPV4的mRNA和蛋白的表達(dá)水

5、平，檢測(cè)結(jié)果顯示，與未處理組相比，TGF-β1處理后，TRPV4的 mRNA和蛋白水平明顯升高。提示TRPV4在大鼠HSC-T6細(xì)胞中增殖、活化過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。采用LipofectamineTM2000介導(dǎo)的siRNA技術(shù)特異性沉默大鼠HSC-T6細(xì)胞內(nèi)TRPV4，首先通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)觀察大鼠HSC-T6細(xì)胞凋亡情況，并采用qRT-PCR、Western blot檢測(cè) Bax、Caspase3 mRNA水平以及 Bax、pr

6、o-caspase3蛋白水平。qRT-PCR、Western blot結(jié)果顯示，與TGF-β1處理組相比，特異性阻斷TRPV4的表達(dá)，可明顯提高 Bax、Caspase3 mRNA水平以及Bax、pro-caspase3蛋白水平。流式結(jié)果顯示，與TGF-β1處理組相比，特異性阻斷TRPV4的表達(dá)，可明顯促進(jìn)大鼠HSC-T6細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)。與之相應(yīng)的，通過(guò)TRPV4的特異性激動(dòng)劑1uM4α-PDD激活TRPV4，qRT-PCR、Wes

7、tern blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與TGF-β1處理組相比，Bax、Caspase3 mRNA水平以及Bax、pro-caspase3蛋白水平明顯下降。提示，在細(xì)胞活化的過(guò)程中，TRPV4可以抑制凋亡蛋白的表達(dá)，可能起到調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用。
　　2.自噬在大鼠HSC-T6細(xì)胞中的水平及TRPV4對(duì)自噬水平的影響機(jī)制研究
　　qRT-PCR、Western blot檢測(cè)顯示，與未處理組相比，TGF-?1處理后，LC3的mRNA和

8、蛋白水平明顯升高，P62的mRNA和蛋白水平明顯降低。特異性阻斷TRPV4，qRT-PCR、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與TGF-?1處理組相比，LC3的mRNA和蛋白水平明顯降低，P62的mRNA和蛋白水平明顯升高，吖啶橙染色結(jié)果顯示，自噬小泡明顯減少。激活TRPV4后，qRT-PCR、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與TGF-?1處理組相比，LC3的mRNA和蛋白水平明顯升高，P62的mRNA和蛋白水平明顯降低，吖啶

9、橙染色結(jié)果顯示，自噬小泡明顯減少。為了進(jìn)一步研究TRPV4對(duì)自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制，大量文獻(xiàn)證實(shí)，AKT通路是自噬的經(jīng)典上游通路。通過(guò)特異性阻斷TRPV4，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與TGF-?1處理組相比，p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯降低。以上結(jié)果提示，在細(xì)胞活化的過(guò)程中，TRPV4可能是通過(guò)激活A(yù)KT通路繼而上調(diào)自噬。
　　3.在大鼠HSC-T6細(xì)胞中自噬對(duì)凋亡蛋白表達(dá)的影響
　　使用自噬抑制劑氯喹抑制自噬的水平，qR

10、T-PCR、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與TGF-?1處理組相比，Bax、Caspase3 mRNA水平以及Bax、pro-caspase3蛋白水平明顯升高。提示在大鼠HSC-T6細(xì)胞中，抑制自噬水平可明顯促進(jìn)凋亡蛋白的表達(dá)。為了進(jìn)一步探討TRPV4與自噬和凋亡蛋白變化之間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，在抑制自噬的基礎(chǔ)上激活TRPV4，與TRPV4不處理組比較，凋亡蛋白沒(méi)有明顯的變化。證實(shí)TRPV4可能是通過(guò)激活自噬進(jìn)而抑制凋亡凋亡蛋白的