脂多糖對大鼠肝星狀細胞系HSC-T6細胞自噬的影響及NF-κB通路在其中的作用.pdf

1、肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是各種致病因素引起慢性肝損傷后最終形成肝硬化的必經(jīng)病理階段，其中肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化、增殖并產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)是關(guān)鍵。研究表明各種肝臟疾病常伴有腸源性內(nèi)毒素血癥，且內(nèi)毒素的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可促進HF的發(fā)生與發(fā)展，但其機制尚不完全清楚。自噬（autophagy）是細胞自身損傷或過剩的結(jié)構(gòu)通過

2、溶酶體機制而被分解使之可再利用的過程，是一種對細胞內(nèi)過剩的、錯誤折疊的、損壞的和有害的蛋白進行清除和降解的過程。近年來，越來越多的研究表明細胞自噬在HF的發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用。核因子-кB（nuclear factor-кB，NF-кB）作為LPS導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)及HF等過程中的重要信號通路之一，是否影響活化的HSCs細胞自噬也有待闡明。本實驗以大鼠肝星狀細胞系（HSC-T6）為研究對象，初步探討LPS對HSC-T6自噬的影響及可能

3、機制。
　　第一部分：脂多糖對大鼠肝星狀細胞系HSC-T6細胞自噬的影響
　　目的：
　　研究不同濃度及不同培養(yǎng)時間的LPS對體外培養(yǎng)的HSC-T6細胞自噬的影響。
　　方法：
　　(1)體外HSC-T6細胞培養(yǎng)，劑量效應(yīng)組分別用質(zhì)量濃度0、0.01、0.1、1、10 mg/L的LPS處理HSC-T624 h；時間效應(yīng)組用濃度為0.1 mg/L的LPS分別處理HSC-T60 h、3 h、6 h、12 h、1

4、8 h、24 h后，Western blot檢測細胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白LC3Ⅱ及Beclin1含量。
　　(2)采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較用Tukey檢驗。
　　結(jié)果：
　　(1)不同質(zhì)量濃度LPS對HSC-T6自噬的影響。
　　不同質(zhì)量濃度的LPS與HSC-T6共培養(yǎng)24 h后，在LPS質(zhì)量濃度為0.01、0.1 mg/L時HSC

5、-T6自噬蛋白LC3Ⅱ含量較0 mg/L組相比顯著增加且在LPS濃度為0.1 mg/L時LC3Ⅱ含量達到峰值（P<0.05），0.01、0.1、1 mg/L的LPS處理HSC-T6細胞24 h后，HSC-T6細胞中Beclin1含量較0 mg/L組顯著增加且在LPS濃度為0.1 mg/L時Beclin1含量達到峰值（P<0.05）；在LPS濃度為10 mg/L時，LC3Ⅱ及Beclin1含量較0 mg/L組顯著較少（P<0.05）。

6、r>　　(2)不同處理時間的LPS對HSC-T6自噬的影響。
　　0.1 mg/LLPS處理HSC-T66～18 h時LC3Ⅱ及Beclin1水平與0 h相比顯著增加，且在LPS處理6 h時LC3Ⅱ及Beclin1含量達到峰值(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　LPS促進HSC-T6細胞自噬且在LPS濃度為0.1 mg/L作用6 h達到峰值。
　　第二部分：NF-кB通路在LPS誘導(dǎo)的中的大鼠肝星狀細胞系HSC-

7、T6細胞自噬中的作用
　　目的：
　　研究NF-кB通路在LPS誘導(dǎo)的HSC-T6細胞自噬中的作用。
　　方法：
　　(1)體外HSC-T6細胞培養(yǎng)，依據(jù)給藥的不同隨機分為對照組、LPS組、PDTC組、LPS+PDTC組、PMA組和LPS+PMA組。
　　(2)Western blot法測定LC3Ⅱ及Beclin1蛋白含量。
　　(3)免疫熒光法觀察NF-кB P65細胞內(nèi)分布情況。
　　(4)

8、比色法檢測各組細胞培養(yǎng)上清清羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）含量。
　　(5)ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清層粘蛋白（Laminin，LN）及透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）含量。
　　(6)采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較用Tukey檢驗。
　　結(jié)果：
　　(1)經(jīng)PDTC預(yù)處理后，LPS刺激的HSC-T