JNK抑制劑對PDGF誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞自噬的影響.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是嗜肝病毒、酒精、藥物和毒物等致病因素引起各種慢性肝病進而逐漸發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)病理過程，是機體對各種持續(xù)的急慢性肝損傷產(chǎn)生的一種損傷修復(fù)反應(yīng)。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellate cells，HSCs)在肝纖維化的形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HSCs在正常情況時處于靜止?fàn)顟B(tài)具有大脂滴結(jié)構(gòu)，合成少量膠原，活化后的HSCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，大脂滴結(jié)構(gòu)消失同時自身增殖和膠原合成增加，

2、這個活化過程與自噬的發(fā)生有關(guān)。自噬(autophagy)是細(xì)胞將自身損傷或過剩的結(jié)構(gòu)通過溶酶體機制而被分解使之可再利用的過程。自噬的發(fā)生包括粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)、高爾基體等來源的雙層磷脂結(jié)構(gòu)的膜包裹部分胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器和衰老或錯誤折疊的蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome)，再通過與溶酶體融合利用其內(nèi)的水解酶降解內(nèi)容物，這個融合后的狀態(tài)叫做自噬溶酶體(autolysosome)。在組織細(xì)胞受到各種理化因素?fù)p

3、傷時，自噬性溶酶體大量增加，使細(xì)胞能夠適應(yīng)環(huán)境變化同時修復(fù)損傷。
　　C-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNE)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的一員。JNK的激活通過三級激酶模式，包括MAP kinase kinase kinases(MAP3Ks orMKKKs),MAP kinase kinases(MAP2Ks o

4、r MKKs)和MAP kinases(JNKs)。JNK可以被許多刺激激活，包括細(xì)胞因子、活性氧(ROS)、病原體、毒素、藥物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、游離脂肪酸和代謝環(huán)境改變。血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是HSCs最強有力的促有絲分裂因子。肝纖維化時PDGF及其受體表達量均有增加，PDGF可以與其受體結(jié)合后激活受體，活化的PDGF受體與許多能夠激活RaS的信號分子有很強的親和力，通

5、過間接激活RaS從而可以進一步激活下游的Raf，進而激活包括MAPKs在內(nèi)的多條信號通路。目前已知的JNK下游蛋白至少有40種。其中，c-Jun（一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，屬亮氨酸拉鏈家族成員）是特征性的下游蛋白，可以與JunB、JunD或者Fos結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的形成，實現(xiàn)包括細(xì)胞代謝、增殖、分化等在內(nèi)的多種生物學(xué)效應(yīng)。
　　迄今，關(guān)于JNK與HSCs的自噬之間的關(guān)系的研究甚少，對于JNK的干預(yù)能否成為抗纖維化治療的一個靶點？為

6、此，我們運用JNK抑制劑SP600125特異性阻斷JNK活性，同時在PDGF誘導(dǎo)下，對JNK在HSCs自噬中的作用做了初步研究。
　　目的:通過應(yīng)用JNK抑制劑SP600125探討JNK在PDGF誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞自噬及活化中的作用。
　　方法:應(yīng)用體外HSCs培養(yǎng)技術(shù)，利用PDGF-BB刺激人肝星狀細(xì)胞系HSC-LX2后，以一定濃度的SP600125阻斷JNK通路。分組如下①對照組;②PDGF組;③SP600125組;④SP6

7、00125+PDGF組。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測HSCs中α-SMA的表達，Westem bloting方法檢測JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、α-SMA、LC3BⅡ（檢測自噬發(fā)生的標(biāo)志性蛋白）、LC3BⅠ、Agt5和Beclin1（自噬起始階段的兩個關(guān)鍵蛋白）蛋白表達，RT-PCR法檢測Agt5和Beclin1的基因水平的表達;采用吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察HSCs自噬情況。
　　結(jié)果:
　　1 SP6001

8、25對PDGF誘導(dǎo)的HSCs的JNK和c-Jun磷酸化具有抑制作用。應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測各組JNK和p-JNK、c-Jun和p-c-Jun蛋白的表達情況。統(tǒng)計p-JNK與JNK、p-c-Jun與c-Jun蛋白灰度的比值，PDGF組較對照組JNK、c-Jun磷酸化水平明顯升高(0.77±0.05 vs0.34±0.02，0.92±0.52 vs0.51±0.05)(p＜0.01)，SP600125+PDGF組和SP6001

9、25組分別較PDGF組和對照組JNK(0.39±0.04 vs0.77±0.05，0.24±0.02 vs0.34±0.02)、c-Jun(0.21±0.04 vs0.92±0.52，0.14±0.01 vs0.51±0.05)磷酸化水平顯著降低（p＜0.05）。
　　2 SP600125對PDGF誘導(dǎo)的HSCs的自噬具有抑制作用。應(yīng)用吖啶橙染色方法結(jié)果顯示，PDGF組較對照組紅色熒光面積明顯升高(130.0±24.1vs54.6

10、±8.3)(p＜0.05)，SP600125+PDGF組較PDGF組紅色熒光的面積顯著降低(50.2±6.6 vs130.0±24.1)(p＜0.05);應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測各組LC3BⅡ、LC3BⅠ、Beclin-1和Atg-5蛋白的表達情況，統(tǒng)計LC3BⅡ與LC3BⅠ的比值和Beclin-1和Atg-5蛋白表達量。PDGF組較對照組LC3BⅡ與LC3BⅠ的比值、Beclin-1和Atg-5蛋白的表達均明顯升高(1.2

11、9±0.21 vs0.66±0.05,746.10±46.33 vs310.20±31.80,1778.00±130.00 vs562.90±60.90)(p＜0.05)。SP600125+PDGF組和SP600125組分別較PDGF組和對照組LC3BⅡ與LC3BⅠ的比值(0.35±0.03 vs l.29±0.21，0.33±0.05 vs0.66±0.05)、Beclin-1蛋白的表達(197.50±26.99 vs746.10±4

12、6.33，133.90±17.96 vs310.20±31.80)均顯著降低(p＜0.05）。SP600125+PDGF組較PDGF組Atg-5蛋白的表達顯著降低(714.20±47.75 vs1778.00±130.00)(p＜0.01)，而SP600125組較對照組Atg-5蛋白的表達量無顯著性差異(p＞0.05）;應(yīng)用Real-time PCR方法檢測Beclin-1 mRNA和Atg-5 mRNA的表達，其結(jié)果與Western

13、blot結(jié)構(gòu)一致。
　　3 SP600125能夠抑制HSCsα-SMA的表達。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測α-SMA蛋白的表達情況。PDGF組較對照組α-SMA蛋白的表達水平明顯升高(1566.00±116.50 vs757.70±72.87)(p＜0.01)，SP600125+PDGF組較PDGF組α-SMA蛋白的表達顯著降低(582.10±60.48vs1566.00±116.50)(p＜0.01)。