自噬抑制劑氯喹對體外活化肝星狀細胞膠原代謝的影響.pdf

1、肝纖維化(Hepaticfibrosis，HE)是各種不同致病因素引起慢性肝病進而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經(jīng)途徑，是肝臟對各種慢性損傷產(chǎn)生的一種修復反應。其主要病理特征是以膠原為主的細胞外間質(extracellularmatrix，ECM)在肝組織內(nèi)的過度合成和異常沉積。肝纖維化是可逆的，而肝硬化則難以逆轉。因此，阻止甚至逆轉肝纖維化是治療各種慢性肝病、預防其向肝硬化發(fā)展的關鍵所在。對于肝纖維化的防治，迄今尚乏真正有效治療手段，

2、深入研究肝纖維化的發(fā)病機制進而探索有效防治措施，對于治療各種慢性肝病，預防其向肝纖維化、肝硬化發(fā)展有著重要意義。
　　 肝星狀細胞(hepaticstellatecells，HSCs)是肝纖維化發(fā)生過程中產(chǎn)生ECM的主要細胞，HSCs活化是肝纖維化形成的細胞學基礎，在肝纖維化發(fā)展過程中扮演重要角色。靜止狀態(tài)下，HSCs胞漿內(nèi)富含脂滴，已有研究表明脂滴的存在能抑制HSCs的活化，而HSCs活化的最具特征性表現(xiàn)是胞漿內(nèi)脂滴的丟失，轉

3、化為肌成纖維細胞，并主要通過兩種作用機制促進肝纖維化進程:以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的ECM成分生成過多，降解不足;合成并釋放一些重要的促進纖維化發(fā)生、慢性炎癥和血管生成的細胞因子。近來，F(xiàn)riedman等研究發(fā)現(xiàn)，在HSCs活化過程中，胞漿內(nèi)脂滴的丟失與自噬(autophagy)相關，自噬可通過降解脂滴為HSCs活化提供能量。相反，抑制自噬可減少HSCs活化并降低其纖維生成能力，主要表現(xiàn)為α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleact

4、in，α-SMA)、Ⅰ型膠原等表達下降。
　　 自噬是指從粗面內(nèi)質網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質等形成自噬體(autophagosome)，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，進一步降解其所包裹的多余的蛋白質和亞細胞成分，以實現(xiàn)細胞本身代謝需要和某些細胞器的更新，維持自身的穩(wěn)定。自噬的整個過程主要分為3個階段:自噬體的初步形成;自噬體膜的延伸;自噬體與溶酶體融合并降

5、解。氯喹(Chloroquine，CQ)可通過升高溶酶體內(nèi)PH值，阻止自噬體與溶酶體的結合而抑制自噬。
　　 目前國內(nèi)外對自噬在肝纖維化中的研究主要側重于其對肝星狀細胞活化的影響，而自噬對活化后的HSCs的生物學作用尚缺乏研究報道。本實驗以此為出發(fā)點，研究應用不同濃度的自噬抑制劑CQ干預活化的HSC-T6細胞后，Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達及基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)、基質金屬蛋白酶組織抑制

6、因子(tissueinhibitionofmatrixmetalloproteinase，TIMPs)的表達變化，旨在完善自噬對HSCs膠原代謝的影響。
　　 目的:研究不同濃度的自噬抑制劑CQ對活化HSC-T6的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響以及該過程中MMP-2、TIMP-2、MMP-13和TIMP-1的表達變化。
　　 方法:應用TGF-β1刺激大鼠肝星狀細胞系HSC-T6，使其處于完全活化狀態(tài)，給予不同濃度的CQ干預24

7、h。實驗分組如下:①Control組，僅以含10％胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，在TGF-β1刺激步驟加入等體積TGF-β1的溶劑枸櫞酸鈉溶液;②TGF-β1組，以含10％胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，待70％融合后加入終濃度為20ng/ml的TGF-β1;③TGF-β1+CQ15μmol/L組，在給予TGF-β1刺激的同時加入濃度為15μmol/L的CQ干預;④TGF-β1+CQ30μmol/L組，在給予TGF-β1刺

8、激的同時加入濃度為30μmol/L的CQ干預;⑤TGF-β1+CQ60μmol/L組，在給予TGF-β1刺激的同時加入濃度為60μmol/L的CQ干預。
　　 采用MTT法檢測細胞活力;Westernblot技術檢測自噬標識蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和P62蛋白的表達情況;免疫細胞化學檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原的定位表達量;Westernblot技術檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-2、TIMP-2、MMP-13和TIMP-1蛋白的表達;R

9、eal-timeQ-PCR檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-2、TIMP-2、MMP-13和TIMP-1基因水平的表達變化。
　　 結果:①用含10％胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，待70％融合后加入TGF-β1，濃度分別為5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml，干預24h后，采用MTT法檢測細胞活力并繪制曲線，起始隨著TGF-β1濃度的升高細胞活力明顯增強，在濃度達到2

10、0ng/ml后，繼續(xù)升高濃度細胞活力增加不明顯。因此，選擇20ng/ml作為本實驗的干預濃度。②應用Westernblot技術檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和P62蛋白在上述5組細胞中的表達，其結果顯示:LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的相對表達量依次為0.63±0.08、0.61±0.12、1±0.1、1.5±0.3、2.4±0.17，TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF-β1組(P＜0.01)，TGF-β1+CQ組之間也有顯著性差異(P＜0.01

11、);P62蛋白的相對表達量依次為4.4±0.4、4.1±0.33、5.9±0.25、6.2±0.31、6.1±0.43，TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF-β1組（P＜0.01），而TGF-β1+CQ組之間無顯著性差異（P＞0.05）。③MTT法檢測細胞活力顯示:以Control組的細胞活力定義為100％，其余4組分別為115％、89％、48％、27％，TGF-β1組較Control組顯著升高，TGF-β1+CQ組較Control組和

12、TGF-β1組均顯著下降（P＜0.01），TGF-β1+CQ組中隨CQ劑量增加，細胞活力下降具有顯著性差異(P＜0.01)。④Westernblot技術檢測α-SMA表達，其相對表達量依次為0.84±0.12、1.23±0.21、1.18±0.16、1.2±0.23、1.31±0.33，TGF-β1組和TGF-β1+CQ組均顯著高于Control組(P＜0.05)，而TGF-β1組和TGF-β1+CQ各組之間無顯著性差異（P＞0.05）

13、。⑤免疫細胞化學染色顯示:TGF-β1組的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達量較Control組顯著增加，TGF-β1+CQ組較TGF-β1組也有明顯增加。⑥應用Westernblot技術檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原在上述5組細胞中的表達，其結果顯示:Ⅰ型膠原的相對表達量依次為0.81±0.13、1.12±0.11、1.43±0.17、1.6±0.14、1.95±0.2，TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF-β1組(P＜0.01)，TGF-β1+CQ30μmol/L

14、組顯著高于TGF-β1+CQ15μmol/L組(P＜0.01)，TGF-β1+CQ60μmol/L組顯著高于TGF-β1+CQ30μmol/L組(P＜0.05);Ⅲ型膠原的相對表達量依次為0.84±0.15、1.28±0.2、1.84±0.13、3.1±0.23、3.9±0.32,TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF-β1組(P＜0.01)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異（P＜0.01）。⑦應用Real-timeQ-PCR方法

15、檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達，其結果顯示:以Control組的mRNA表達量為1，Ⅰ型膠原其余4組的相對表達量依次為1.8±0.06、2.1±0.11、2.5±0.08、2.8±0.13，TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF-β1組(P＜0.05)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異（P＜0.05）;Ⅲ型膠原的相對表達量依次為2.1±0.13、2.7±0.07、3±0.17、3.7±0.09，TGF-β1+CQ組均顯著高于TGF

16、-β1組（P＜0.05），TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異（P＜0.05）。⑧應用Westernblot技術檢測MMP-2和TIMP-2蛋白的表達，其結果顯示:MMP-2蛋白各組的表達量依次為1.01±0.11、0.67±0.08、0.69±0.06、0.71±0.1、0.74±0.09，TGF-β1組和TGF-β1+CQ組較Control組明顯下降(P＜0.05)，但TGF-β1組和TGF-β1+CQ各組之間沒有顯著性差異;T

17、IMP-2的相對表達量依次為0.87±0.08、1.19±0.13、1.31±0.11、1.58±0.17、1.82±0.16，TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著增加（P＜0.05），TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異(P＜0.05)。⑨應用Real-timeQ-PCR方法檢測MMP-2和TIMP-2的mRNA表達，其結果顯示:以Control組的mRNA表達量為1，MMP-2其余4組的相對表達量依次為2.61±0.11、2

18、.8±0.1、3.2±0.14、3.8±0.17，TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著增加(P＜0.05)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異（P＜0.05）;TIMP-2其余4組的相對表達量依次為1.5±0.03、2.8±0.06、3.6±0.06、4.2±0.02，TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著增加(P＜0.05)，TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異（P＜0.01）。⑩應用Westernblot技術檢測MM

19、P-13和TIMP-1蛋白的表達，其結果顯示:MMP-13蛋白各組的表達量依次為:1.64±0.03、1.27±0.07、0.84±0.1、0.55±0.07、0.46±0.09,TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著下降（P＜0.05），TGF-β1+CQ各組之間也有顯著性差異(P＜0.05);TIMP-1蛋白各組的表達量依次為:0.84±0.11、1.02±0.09、1.25±0.04、1.48±0.12、1.6±0.05，TGF

20、-β1+CQ組顯著高于TGF-β1組（P＜0.01），TGF-β1+CQ各組之間具有顯著性差異(P＜0.01)。(⑾)應用Real-timeQ-PCR方法檢測MMP-13和TIMP-1的mRNA表達，其結果顯示:以Control組的mRNA表達量為1，MMP-13其余4組的相對表達量依次為3.1±0.12、2.2±0.06、1.8±0.03、1.2±0.03，TGF-β1+CQ組較TGF-β1組顯著下降(P＜0.05)，TGF-β1+C