氧化苦參堿對脂多糖誘導(dǎo)的胰腺星狀細(xì)胞TLR4-NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：觀察氧化苦參堿（oxymatrine，OM）在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的胰腺星狀細(xì)胞（LTC-14細(xì)胞株）中對Toll樣受體4（toll-like receptor4，TLR4）通路中相關(guān)細(xì)胞因子的影響。其中包括：TLR4、髓樣細(xì)胞分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）、核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(nuclear factor kappa B，

2、NF-κB)、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）在基因和蛋白水平的表達(dá)變化。探討OM治療慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）纖維化的可能分子機(jī)制。
　　方法：將LTC-14細(xì)胞株分為4個組，Control組，LPS組，OM+LPS組，OM組。Control組：加無血清無雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)3h。LPS組：加入含濃度為10μg/ml LPS的無血清無雙抗的培養(yǎng)基孵育3h

3、；OM+LPS組：先加入500μg/ml的OM在無血清無雙抗的培養(yǎng)基中孵育30min，然后加入濃度為10μg/ml LPS繼續(xù)刺激3h；OM組：單純加入含500μg/ml OM的無血清無雙抗的培養(yǎng)基孵育3h。該實驗中應(yīng)用到的實驗方法（1）采用免疫熒光方法檢測 LTC-14細(xì)胞株 TLR4的表達(dá)。（2）應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)了解NF-κB在細(xì)胞漿和細(xì)胞核的表達(dá)。（3）利用 Western Blot技術(shù)檢測氧化苦參堿對 LPS誘導(dǎo)的LTC-1

4、4細(xì)胞中 TLR4、MyD88及NF-κB在蛋白水平表達(dá)的影響。（4）通過實時熒光定量PCR檢測氧化苦參堿對LPS誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中TLR4、MyD88及NF-κB在基因水平的表達(dá)變化。（5）通過ELISA試驗檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α的蛋白水平。
　　結(jié)果：與Control組相比，LPS組TLR4、NF-κB在mRNA和蛋白水平上表達(dá)量顯著增加，同時OM+LPS組較LPS組表達(dá)顯著下降，有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。OM組

5、較Control組對比，無統(tǒng)計學(xué)意義。通過免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可以觀察到LPS組較Control組發(fā)生顯著的NF-κB核內(nèi)易位,OM+LPS組較LPS組,核內(nèi)易位明顯減少。OM也可以下調(diào)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α的蛋白表達(dá)，MyD88 mRNA和蛋白表達(dá)各組之間比較，無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：對LPS誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)及NF-κB向核內(nèi)易位抑制作用可能是OM治療胰腺纖維化的機(jī)制之一。