TLR4介導(dǎo)的信號通路對肝細(xì)胞凋亡的影響及氧化苦參堿的干預(yù)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號通路對大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡的影響
　　目的：
　　探討大鼠肝BRL-3A細(xì)胞中是否有Toll樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）介導(dǎo)的PI3K/AKT/GSK3β信號通路，及該通路在BRL-3A細(xì)胞凋亡中的作用與機(jī)制，為急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　采用大鼠肝

2、BRL-3A細(xì)胞，運(yùn)用脂多糖（lipopolsaccharide，LPS）建立肝細(xì)胞凋亡模型。分別應(yīng)用TLR4抑制劑（CLI-095）、PI3K/AKT抑制劑（LY294002）和GSK3β抑制劑（LiCl）預(yù)處理BRL-3A細(xì)胞，以減弱或加強(qiáng)TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。CCK-8法檢測細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞凋亡率；Hoechst33342染色法觀察LPS刺激及

3、TLR4抑制劑阻斷后細(xì)胞凋亡的形態(tài)；Western-blot法檢測BRL-3A細(xì)胞內(nèi)AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9、Bax、Bcl-2及active-caspase-3蛋白的表達(dá)；實(shí)時定量PCR法（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測BRL-3A細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2及caspase-3 mRNA的表達(dá)；免疫熒光法觀察GSK3β核易位情況。
　　結(jié)果：

4、r>　?。?）CCK-8法結(jié)果顯示，LPS（10μg/ml）刺激BRL-3A細(xì)胞不同時間（1、3、6、12、24 h）后，細(xì)胞活力均明顯低于對照組（P<0.05），LPS作用于BRL-3A細(xì)胞24 h后其活力為對照組的58％（P<0.05）。
　?。?）Hoechst33342染色法結(jié)果顯示，LPS刺激后，隨著刺激時間的延長，BRL-3A細(xì)胞凋亡增多，并出現(xiàn)壞死細(xì)胞，刺激24 h可見細(xì)胞核碎片和核固縮。TLR4抑制劑（CLI-09

5、5）預(yù)處理組凋亡細(xì)胞明顯減少，未見凋亡小體。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，LPS（10μg/ml）刺激BRL-3A細(xì)胞不同時間（1、3、6、12、24 h）后，細(xì)胞凋亡率逐漸上升（P<0.01），24 h BRL-3A細(xì)胞凋亡率達(dá)68.30%。與 LPS組比較，CLI-095+ LPS組可以減少 LPS刺激引起的 BRL-3A細(xì)胞凋亡率（P<0.05）；LY294002+LPS組細(xì)胞凋亡率增加（P<0.05）；LiCl+LPS組

6、細(xì)胞凋亡率下降（P<0.05）。
　　（4）Western-blot法結(jié)果顯示，正常對照組BRL-3A細(xì)胞中有AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9的表達(dá)；LPS組P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表達(dá)低于正常對照組（P<0.05）；與LPS組比較，CLI-095+LPS組P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表達(dá)有所上調(diào)；而LY294002+LPS組的P-AKTSer473和P

7、-GSK3βSer9表達(dá)下調(diào)（P<0.05）；LiCl+LPS組P-GSK3βSer9的表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。
　?。?）免疫熒光法檢測GSK3β核易位結(jié)果顯示，正常對照組中GSK3β主要表達(dá)在BRL-3A細(xì)胞質(zhì)中；LPS組GSK3β大多易位到胞核；與LPS組比較，CLI-095、LiCl預(yù)處理組GSK3β核易位均不同程度減弱，LY294002預(yù)處理組GSK3β核易位作用增強(qiáng)。
　?。?）RT-qPCR法檢測結(jié)果顯示，與

8、正常對照組比較，LPS組 Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA的表達(dá)均上調(diào)（P<0.05）；與LPS組比較，CLI-095+LPS組及LiCl+LPS組Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達(dá)降低（P<0.05）；LY294002+LPS組Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。
　?。?）Western-blot法測定結(jié)果顯示，與正常對照組比較，LPS組 Bax/Bcl-

9、2及active-caspase-3表達(dá)均上調(diào)（P<0.05）。與LPS組比較，CLI-095+LPS組及LiCl+LPS組Bax/Bcl-2及active-caspase-3表達(dá)降低（P<0.05）；LY294002+ LPS組Bax/Bcl-2及active-caspase-3表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）BRL-3A細(xì)胞中有TLR4介導(dǎo)的PI3K/AKT/GSK3β信號通路。
　　（2）BRL

10、-3A細(xì)胞 TLR4激活后，P-AKTSer473和 P-GSK3βSer9表達(dá)下調(diào)，使Bax/Bcl-2及active-caspase-3的表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡率升高。BRL-3A細(xì)胞凋亡過程中有TLR4介導(dǎo)的PI3K/AKT/GSK3β信號通路的參與。
　　第二部分 TLR4/P38/JNK信號通路對大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡的影響
　　目的：
　　探討大鼠肝BRL-3A細(xì)胞中是否有TLR4介導(dǎo)的P38/JNK信號通

11、路，及該通路在BRL-3A細(xì)胞凋亡中的作用與機(jī)制，為急性肝衰竭的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　采用大鼠肝BRL-3A細(xì)胞，應(yīng)用LPS建立肝細(xì)胞凋亡模型。分別運(yùn)用TLR4抑制劑（CLI-095）、P38抑制劑（SB203580）、JNK抑制劑（SP600125）及 ERK抑制劑（FR180204）預(yù)處理BRL-3A細(xì)胞，以影響TLR4/P38/JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；Western-bl

12、ot法檢測BRL-3A細(xì)胞內(nèi)JNK、P-JNK、P38、P-P38、Bax、Bcl-2及active-caspase-3蛋白的表達(dá)； RT-qPCR檢測大鼠肝細(xì)胞Bax、Bcl-2及caspase-3 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　（1）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，LPS組細(xì)胞凋亡率高于正常對照組（P<0.05）；而CLI-095+LPS組、SB203580+LPS組、SP600125+LPS組細(xì)胞凋亡率顯著低于LPS組（P<0

13、.05）；FR180204+LPS與LPS組比較無明顯差異。
　?。?）Western-blot結(jié)果顯示，LPS組 P-P38，P-JNK表達(dá)明顯高于正常對照組（P<0.05）；CLI-095+LPS組、SB203580+LPS組、SP600125+LPS組P-P38，P-JNK表達(dá)顯著低于LPS組（P<0.05）；FR180204+LPS組與LPS組比較無明顯差異。
　?。?）RT-qPCR結(jié)果顯示，LPS組Bax/Bcl

14、-2及caspase-3 mRNA明顯高于正常對照組（P＜0.05）；CLI-095+LPS組、SB203580+LPS組和SP60012+LPS組Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達(dá)均顯著低于LPS組（P<0.05）；FR180204+LPS組Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達(dá)無明顯變化。
　　（4）Western-blot結(jié)果顯示，LPS組Bax/Bcl-2及active-caspase-3表

15、達(dá)比正常對照組高（P<0.05）；CLI-095+LPS組、SB203580+LPS組和SP60012+LPS組Bax/Bcl-2及active-caspase-3表達(dá)顯著低于LPS組（P<0.05）；FR180204+ LPS組與LPS組比較無明顯差異。
　　結(jié)論：
　?。?）BRL-3A細(xì)胞中有TLR4介導(dǎo)的P38/JNK信號通路。
　?。?）BRL-3A細(xì)胞TLR4激活后，P-P38、P-JNK表達(dá)增加，使Bax

16、/Bcl-2的比例和active-caspase-3表達(dá)增加，從而促進(jìn)BRL-3A細(xì)胞的凋亡。BRL-3A細(xì)胞凋亡過程中有TLR4介導(dǎo)的P38/JNK信號通路的參與。
　　第三部分氧化苦參堿對大鼠肝BRL-3A細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制研究
　　目的：
　　探討氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）對 LPS誘導(dǎo)的大鼠肝 BRL-3A細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制，為 OMT抑制肝細(xì)胞凋亡提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　

17、　方法：
　　采用 LPS誘導(dǎo)大鼠肝 BRL-3A細(xì)胞建立細(xì)胞凋亡模型。應(yīng)用 CCK-8法測定 OMT對 BRL-3A細(xì)胞活力的影響；生物化學(xué)法測定不同劑量 OMT對 LPS誘導(dǎo)的 BRL-3A細(xì)胞乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放率的影響。根據(jù) LDH釋放率選擇OMT濃度為0.75、1.5、3.0 g/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后實(shí)驗(yàn)分5組：正常對照組，LPS組，OMT低劑量+LPS組，OMT中劑量+L

18、PS組，OMT高劑量+LPS組。Hochest33342染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；RT-qPCR法檢測BRL-3A細(xì)胞中Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA的表達(dá)；Western-blot法檢測BRL-3A細(xì)胞中AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9、P38、P-P38、JNK、P-JNK、Bax、Bcl-2和 active-caspase-3蛋白的表達(dá)；免疫熒光觀察GSK3

19、β核易位情況。
　　結(jié)果：
　　（1）不同劑量的（0.375～6.0 g/L）OMT和 BRL-3A細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，BRL-3A細(xì)胞生長狀態(tài)良好。
　?。?）LPS刺激 BRL-3A細(xì)胞后，LDH釋放率增加（P<0.01），而OMT預(yù)處理后能明顯降低 LDH的釋放率（P<0.05或 P<0.01）。
　?。?）CCK-8法結(jié)果顯示，LPS組細(xì)胞活力明顯降低（P<0.05），OMT預(yù)處理可以明顯減弱由 LPS引

20、起的細(xì)胞活力降低（P<0.05或 P<0.01）。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：LPS組 BRL-3A細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對照組（P<0.05），OMT預(yù)處理可以顯著降低由 LPS刺激引起 BRL-3A細(xì)胞凋亡率的增加（P<0.05）。
　　（5）Hochest33342染色結(jié)果顯示，LPS組可見 BRL-3A細(xì)胞凋亡增多，OMT預(yù)處理后凋亡細(xì)胞明顯減少。
　?。?）Western-blot檢測結(jié)果顯示，LPS組

21、TLR4表達(dá)增加（P<0.05），P-AKTSer473和 P-GSK3βSer9表達(dá)降低（P<0.05），P-P38、P-JNK表達(dá)增加（P<0.05）；與 LPS組比較，OMT中、高劑量預(yù)處理可以下調(diào) TLR4的表達(dá)，并上調(diào) P-AKTSer473和 P-GSK3βSer9的表達(dá)（P<0.05），下調(diào) P-P38、P-JNK的表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。
　?。?）免疫熒光結(jié)果顯示，OMT預(yù)處理能明顯減少 LPS刺激引

22、起的 GSK3β核易位。
　?。?）RT-qPCR結(jié)果顯示，LPS組 Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達(dá)明顯增高（P<0.05）。與 LPS組比較，OMT預(yù)處理能明顯降低由 LPS誘導(dǎo)的 BRL-3A細(xì)胞中 Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05或 P<0.01）。
　　（9）Western-blot結(jié)果顯示，OMT預(yù)處理能明顯降低由 LPS誘導(dǎo)的 BRL-3A細(xì)胞中 Bax

23、/Bcl-2及active-caspase-3表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論
　　（1）OMT預(yù)處理可以顯著降低由LPS誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞凋亡。
　?。?）OMT能上調(diào)經(jīng)LPS刺激的BRL-3A細(xì)胞P-AKTSer473和P-GSK3βSer9水平，減少LPS刺激引起的GSK3β核易位，降低經(jīng)LPS激活的P38和JNK磷酸化水平，下調(diào)Bax/Bcl-2的比例和active-caspase-3的表達(dá)，從而明顯抑

24、制BRL-3A細(xì)胞凋亡。
　?。?）OMT通過TLR4/PI3K/AKT/GSK3β及TLR4/P38/JNK信號通路抑制BRL-3A細(xì)胞凋亡。
　　第四部分氧化苦參堿對急性肝衰竭大鼠肝細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制研究
　　目的：
　　探討氧化苦參堿（OMT）對LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠肝細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制，為臨床防治急性肝衰竭抑制肝細(xì)胞凋亡尋找有效的藥物。
　　方法：
　　采用L

25、PS/D-GalN建立大鼠急性肝衰竭模型。100只大鼠隨機(jī)分為5組：正常對照組，模型組，OMT低、中、高劑量組。應(yīng)用HE染色光鏡觀察肝臟病理學(xué)改變；透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡情況；全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平；ELISA法測定各組大鼠外周血腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis

26、 factor，TNF-α）和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平；流式細(xì)胞術(shù)測定各組大鼠肝細(xì)胞凋亡率；Western-blot檢測肝組織中AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9、P38、P-P38、JNK、P-JNK、Bax、Bcl-2和active-caspase-3的表達(dá)。免疫組化 S-P法觀察肝組織TLR4、Bax、Bcl-2和 active-caspase-3的表達(dá)；

27、　　結(jié)果：
　　（1）各組大鼠死亡率及肝臟大體情況，正常對照組和 OMT低、中、高劑量組無大鼠死亡；模型組大鼠死亡率達(dá)30%。模型組可見肝臟大體腫脹明顯，表面彌漫出血，大片瘀斑，呈暗紅色，OMT低、中、高劑量組肝臟大體不同程度的好轉(zhuǎn)。
　?。?）HE染色見模型組肝細(xì)胞明顯壞死，大片狀壞死和出血，僅少量肝細(xì)胞殘存，散在分布，無正常肝小葉結(jié)構(gòu)，纖維網(wǎng)狀支架塌陷，匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤。透射電鏡顯示模型組肝細(xì)胞壞死明顯，形態(tài)不規(guī)則

28、，可見核皺縮和核碎裂，見凋亡小體，肝細(xì)胞內(nèi)線粒體嚴(yán)重?fù)p害，無明顯細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。OMT各劑量預(yù)處理可不同程度改善肝組織病理損傷。
　?。?）生化分析儀測定結(jié)果顯示，模型組大鼠外周血 AST、ALT的水平明顯高于正常對照組（P<0.05），OMT各劑量組，AST、ALT的水平顯著低于模型組（P<0.05）。
　?。?）ELISA法結(jié)果顯示，模型組大鼠外周血 TNF-α和 IL-1β水平明顯高于正常對照組（P<0.01），OMT各劑

29、量組，TNF-α和 IL-1β水平顯著低于模型組（P<0.05或P<0.01）。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，模型組肝細(xì)胞凋亡率明顯增加（P<0.05），與模型組比較，OMT中、高劑量預(yù)處理可以降低肝細(xì)胞凋亡率（P<0.05）。
　?。?）Western-blot法結(jié)果顯示，模型組TLR4表達(dá)增加（P<0.05），P-AKTSer473和P-GSK3βSer9表達(dá)降低（P<0.05），P-P38、P-JNK表達(dá)增加（P<0

30、.05）；與模型組比較，OMT中、高劑量預(yù)處理可以下調(diào) TLR4的表達(dá)（P<0.05），并上調(diào)P-AKTSer473和 P-GSK3βSer9的表達(dá)（P<0.05），下調(diào) P-P38、P-JNK的表達(dá)（P<0.05）。
　?。?）Western-blot法檢測Bax/Bcl-2比例和 active-caspase-3蛋白結(jié)果顯示，模型組 Bax/Bcl-2比例和 active-caspase-3蛋白的表達(dá)明顯高于正常對照組（P<0

31、.05）。與模型組比較，OMT預(yù)處理可下調(diào) Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白的表達(dá)（P<0.05）。
　?。?）免疫組化法結(jié)果顯示，模型組 TLR4、Bax、active-caspase-3表達(dá)明顯增高，Bcl-2的表達(dá)較正常對照組有所下降（P<0.05）。與模型組比較，OMT預(yù)處理可下調(diào) TLR4、active-caspase-3及 Bax的表達(dá)，上調(diào) Bcl-2的表達(dá)（P<0.05）。
　　結(jié)

32、論：
　?。?)OMT預(yù)處理能改善LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠肝組織病理損傷，明顯降低血清轉(zhuǎn)氨酶，保護(hù)肝細(xì)胞。
　　（2）OMT能降低急性肝衰竭大鼠肝組織 TLR4的表達(dá)、上調(diào) P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表達(dá)，下調(diào) GSK3β表達(dá)；下調(diào) P-P38、P-JNK的表達(dá)，使TNF-α和IL-1β水平降低，下調(diào) Bax/Bcl-2比例和 active-caspase-3蛋白的表達(dá)，從而明顯抑制肝細(xì)