TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)的云芝糖肽免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:研究云芝糖肽(PSP)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞及荷瘤小鼠脾臟TLR4信號(hào)通路的調(diào)控作用，從體外和體內(nèi)探討PSP免疫調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外分離C57BL/10J（正常對(duì)照）小鼠和C57BL/10ScCr(TLR4基因缺陷)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，各分為3組，即正常對(duì)照組、PSP組(25μg/ml)和陽(yáng)性對(duì)照LPS組(100 ng/ml)，采用ELISA檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤

2、壞死因子α(TNF-α)含量，Western blot檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞中TLR4信號(hào)通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)水平。
　　2.采用C57BL/10J（正常對(duì)照）小鼠和C57BL/10ScCr（TLR4基因缺陷）小鼠建立EAC實(shí)體型荷瘤小鼠模型，各分為4組:生理鹽水對(duì)照組、阿霉素化療組、PSP組和LPS組，給藥25天后，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠實(shí)體瘤、胸腺和脾等組織，稱(chēng)量后計(jì)算抑瘤率和臟器指數(shù)。應(yīng)用定量PCR(Q-PCR)

3、檢測(cè)各組小鼠脾臟中TLR4信號(hào)通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)基因表達(dá)水平，采用Western blot檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)ELISA結(jié)果顯示，正常對(duì)照B10(TLR4+/+)小鼠LPS組和PSP組巨噬細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6的含量較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，而TLR4基因缺陷ScCr(TLR4-/-)小鼠三組細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6的含量無(wú)明顯差異(P＞0.05)。Western

4、blot結(jié)果顯示，PSP和LPS顯著上調(diào)B10(TLR4+/+)小鼠巨噬細(xì)胞中TLR4及其下游信號(hào)分子TRAF6蛋白表達(dá)水平以及NF-κB p65和AP-1蛋白的磷酸化水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而對(duì)ScCr(TLR4-/-)小鼠巨噬細(xì)胞無(wú)明顯作用(P＞0.05)。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)抑瘤率及臟器指數(shù)結(jié)果顯示，在正常對(duì)照B10(TLR4+/+)荷瘤小鼠中，ADM治療組和PSP治療組對(duì)EAC實(shí)體瘤均有抑制作用(P＜0.0

5、5)，抑瘤率分別為40.68％和25.20％;相比，ADM治療組小鼠胸腺對(duì)照組明顯萎縮(P＜0.05)，脾臟指數(shù)較NS組有下降但無(wú)顯著差異(P＞0.05)。PSP治療組可以顯著緩解ADM導(dǎo)致的胸腺及脾臟的萎縮(P＜0.05)。在TLR4基因缺陷ScCr(TLR4-/-)荷瘤小鼠中，ADM組對(duì)實(shí)體瘤有明顯抑制作用(P＜0.05)，抑瘤率為38.21％，而PSP治療組對(duì)實(shí)體瘤雖有一定的影響，但與NS對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P＞0.05); PS

6、P和ADM處理組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)雖有一定變化，但是差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Q-PCR和Western blot結(jié)果顯示，PSP和陽(yáng)性對(duì)照LPS均可以上調(diào)B10(TLR4+/+)荷瘤小鼠脾臟TLR4信號(hào)通路中TLR4、TRAF6、NF-κB和AP-1基因和蛋白的表達(dá)量(P＜0.05)，而在ScCr(TLR4-/-)荷瘤小鼠中，PSP和LPS對(duì)脾臟TLR4信號(hào)通路中TLR4、TRAF6、NF-κB和AP-1基因和蛋白的表達(dá)有一定