人參皂苷Rg1和Re通過TLR4通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗內(nèi)毒素作用.pdf

1、人參皂苷(Ginsenoside)作為人參（Panax ginseng C.A.Meyer）的主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)功能。人參皂苷Rg1和Re是人參中含量較多的兩種物質(zhì)，同屬于原人參三醇型皂苷。前期研究發(fā)現(xiàn)，Rg1和Re均具有免疫調(diào)節(jié)作用，Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)是免疫調(diào)節(jié)的一個重要受體，也是細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)產(chǎn)生急性炎癥作用的一個關(guān)鍵受體。革蘭氏陰性菌感染機(jī)體后，細(xì)菌死亡，釋放出L

2、PS結(jié)合到TLR4迅速激活下游的信號通路，過量表達(dá)炎癥介質(zhì)、損害組織器官、出現(xiàn)急性敗血癥，甚至敗血性休克，危機(jī)生命。本文首先研究Rg1和Re的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)Rg1和Re通過TLR4途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用;在此基礎(chǔ)上，探討Rg1和Re干擾LPS結(jié)合巨噬細(xì)胞受體上的TLR4釋放炎癥介質(zhì)，并研究Rg1和Re抗內(nèi)毒素以及抗大腸桿菌感染作用。
　　1.Rg1和Re的免疫佐劑作用與TLR4信號通路關(guān)系的研究
　　目的:了解Rg1和

3、Re的免疫佐劑作用與TLR4信號通路關(guān)系。方法:1）將Rg1和Re分別與模式抗原卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)免疫TLR4突變型小鼠(C3H/HeJ)和其野生型小鼠后，檢測抗原特異性免疫反應(yīng);2）用抗TLR4抗體封閉RAW-Blue細(xì)胞的TLR4，然后用LPS刺激細(xì)胞，比較封閉前后細(xì)胞上清中堿性磷酸酶的分泌情況，間接反映細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nucleartranscription factor-κB，NF-κB)的活化情況;

4、3）用Rg1分別刺激來自TLR4突變型和野生型小鼠的巨噬細(xì)胞，用Western blot檢測胞內(nèi)NF-κB的磷酸化情況;4）應(yīng)用分子對接技術(shù)模擬LPS、Rg1和Re與TLR4-MD-2分子的相互作用。
　　結(jié)果:1）Rg1和Re在野生型小鼠(C3H/HeB)體內(nèi)能夠，但在TLR4突變小鼠(C3H/HeJ)體內(nèi)不能夠，顯著提高抗OVA特異性IgG抗體水平、脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，白介素(IL)-12、干擾素(IFN)-γ、白介素(IL

5、)-4和白介素(IL)-10等細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)水平;2）Rg1和Re能夠激活小鼠巨噬細(xì)胞系中NF-κB，但是用抗體封閉細(xì)胞膜上的TLR4明顯抑制Re對NF-κB的活化作用，而不能抑制Rg1的活化作用;3）Rg1在正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中能夠迅速激活NF-κB亞基發(fā)生磷酸化，然而在TLR4突變小鼠巨噬細(xì)胞中則不能;4）推測Re、Rg1作用方式和LPS類似，在TLR4和MD-2分子之間起到了“橋梁”作用，促進(jìn)了它們的二聚化。R

6、g1和Re與TLR4/MD-2分子之間親和力分別為（-8.6和-8.4），明顯弱于LPS和TLR4/MD-2之間的親和力(-21.5)。2.Rg1和Re影響LPS作用通路的研究
　　目的:探究Rg1和Re對LPS作用的影響。方法:1）分別用50μg/ml Rg1和Re加入RAW264.7細(xì)胞中，孵育2和6h，用免疫熒光技術(shù)在顯微鏡下觀察這兩種人參皂苷在細(xì)胞內(nèi)外的分布;2）分別用10，30，50，70μg/ml的Rg1和Re加入RA

7、W264.7細(xì)胞中，孵育1h，隨后Alexa fluor594-LPS以終濃度10μg/ml避光加入，刺激1h后，用免疫熒光技術(shù)在共聚焦顯微鏡下觀察這兩種人參皂苷對LPS結(jié)合TLR4的影響;3）分別用10，30，50，70μg/ml的Rg1和Re于LPS刺激前或后1h加入RAW-Blue細(xì)胞中，孵育20 h，檢測細(xì)胞上清中堿性磷酸酶的分泌情況，間接反映細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化情況;4）分別用50μg/ml的Rg1和Re提前加入RAW264

8、.7細(xì)胞中，孵育1h后，加入LPS刺激20 h，檢測白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白介素(IL)-6以及一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)的表達(dá)水平。結(jié)果:1）Rg1不僅分布在細(xì)胞膜上，還能夠穿過胞膜，廣泛地分布到胞質(zhì)中;而Re不能穿過胞膜，只能分布在細(xì)胞膜上;2）Rg1和Re在體外先于LPS刺激細(xì)胞，能夠強(qiáng)烈地下調(diào)LPS介導(dǎo)的信號通路，包括阻止LPS結(jié)合TLR4，抑制LPS誘導(dǎo)NF-κB的活化以及多種促炎性

9、細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）和炎癥介質(zhì)（NO和PGE2）的表達(dá)。但是，當(dāng)Rg1和Re在LPS刺激之后1h加入?yún)s沒有明顯的下調(diào)作用。
　　3.Rg1和Re在LPS染毒動物模型的保護(hù)作用
　　目的:觀察Rg1和Re對LPS染毒動物的保護(hù)作用。方法:1）30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別依次尾靜脈注射人參皂苷Rg1(1 mg/kg)、Re(1 mg/kg)和TAK-242(1 mg/kg)和生理鹽水。1

10、5 min后除空白對照組外其余各組均攻靜脈注射LPS。LPS染毒后檢測各組動物的體溫，血液白細(xì)胞數(shù)以及血清中促炎性細(xì)胞因子;2）Rg1和Re的預(yù)防性保護(hù)試驗(yàn)中，各自設(shè)70只BALB/c小鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，分別3次皮下注射Rg1/Re(2.5、5、10、20 mg/kg)和TAK-242(5 mg/kg)，間隔30 min; LPS單獨(dú)注射組和空白對照組分別皮下注射生理鹽水。最后一次皮下注射結(jié)束15 min后，除空白組外，各組腹

11、腔注射LPS(20 mg/kg)。觀察小鼠的行為、狀態(tài)和死亡情況;3）將BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，除空白組外，各組均腹腔注射LPS(20 mg/kg)。15 min后除空白組和LPS單獨(dú)染毒組外，各組分別3次皮下注射Rg1（10 mg/kg）、Re(20 mg/kg)和TAK-242(5 mg/kg)，間隔30 min; LPS單獨(dú)注射組和空白組皮下注射生理鹽水。觀察小鼠的行為、狀態(tài)和死亡情況;4）將45只BALB/c小

12、鼠隨機(jī)分為5組，每組9只，組1-3分別3次皮下注射100μlRg1(10 mg/kg)、Re(20 mg/kg)和TAK-242(5 mg/kg)，間隔30 min。于最后一次注射結(jié)束15 min后，各組均腹腔注射20 mg/kg LPS。組5在染毒15 min后3次皮下注射Rg1(10mg/kg)，間隔30 min。在感染后各個時間點(diǎn)(4，8，12 h)分別從每組取3只小鼠，CO2安樂死后，進(jìn)行血液白細(xì)胞計數(shù)、檢測血清細(xì)胞因子和炎癥介

13、質(zhì)的表達(dá)水平。另外取5只未經(jīng)任何處理的小鼠，安樂死后取樣作為0h的樣品。結(jié)果:1）Rg1和Re在LPS染毒大鼠前靜脈注射能夠顯著緩解LPS引起的發(fā)熱、白細(xì)胞數(shù)量增加和血清促炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6)和炎癥介質(zhì)(NO和PGE2)的高水平表達(dá);2）在小鼠內(nèi)毒素休克模型中，Rg1和Re在染毒前給藥三次能夠有效緩解LPS導(dǎo)致的白細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞數(shù)量的減少以及各種炎癥因子(IL-1β、TNF-α和IL-6、趨化因子KC、

14、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2、NO和PGE2)的過量表達(dá)，并且顯著提高小鼠的存活率。Rg1在染毒后給藥三次仍然能夠有效緩解LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，并使小鼠的存活率從30％提高至90％，但是Re在染毒后給藥對小鼠沒有保護(hù)作用。
　　4.Rg1聯(lián)合PMB給藥對大腸桿菌感染家兔的治療作用
　　目的:觀察Rg1和低劑量的多粘菌素B(Polymyxin B，PMB)聯(lián)合給藥對大腸桿菌感染的家兔的保護(hù)作用。方法:將20只新西蘭大白兔隨機(jī)分成4組，

15、每組5只。大腸桿菌頸部皮下感染(1×109 CFU/kg)后立即分別靜脈注射（左耳）Rg1、PMB和Rg1+PMB;對照組在感染后注射等容量的生理鹽水。然后檢測體溫，血液中細(xì)菌，血清中LPS含量，血清促炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)水平。結(jié)果:聯(lián)合給藥能夠顯著降低血液中的細(xì)菌數(shù)和LPS含量，緩解家兔因感染所致的發(fā)熱、白細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量變化以及血清中各種促炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）的高水平表達(dá)。而低劑

16、量PMB單獨(dú)給藥組的抗炎作用持續(xù)時間很短，只在感染后前8個小時能夠緩解各種炎癥反應(yīng)，在8個小時之后無抗炎作用。另外，單獨(dú)的Rg1給藥對大腸桿菌感染無治療作用。
　　因此，本研究的結(jié)果表明人參皂苷Rg1和Re是通過TLR4信號通路來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用;Rg1和Re與LPS競爭，干擾LPS與TLR4受體的結(jié)合，產(chǎn)生抗LPS作用;Rg1能和細(xì)胞內(nèi)外TLR4結(jié)合，而Re僅和胞外TLR4結(jié)合;Rg1對LPS引起的大鼠和小鼠毒血癥具有預(yù)防和治療