人參皂苷Rg1通過抑制炎癥反應保護黑質多巴胺能神經元的實驗研究.pdf

1、小膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)內重要的免疫細胞，具有分泌細胞因子、呈遞抗原及吞噬病原體等多種功能。研究顯示黑質紋狀體系統(tǒng)是帕金森?。≒arkinson's Disease，PD）主要的病理改變部位，黑質致密帶（substantia nigrapar compacta，SNpc）多巴胺（dopamine，DA）能神經元對小膠質細胞介導的炎癥反應非常敏感。尸檢結果顯示 PD患者的黑質含有大量的反應性小膠質細胞和星形膠質細胞，提示免疫炎癥在PD的

2、發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。因此通過抑制炎癥反應保護中腦黑質 DA能神經元成為PD治療的一種新策略。人參皂苷Rg1是我國傳統(tǒng)中藥人參的主要活性成分，具有多種生理及藥理作用，特別是對中樞神經系統(tǒng)，Rg1具有神經營養(yǎng)和神經保護作用，能夠抑制小膠質細胞的炎癥反應，但Rg1是通過何種機制作用于小膠質細胞發(fā)揮其抗炎作用，目前尚不清楚。Rg1具有類固醇激素樣的甾體骨架結構，本課題組及其他研究小組的研究結果均揭示Rg1可通過類雌激素樣和類糖皮質激素樣的特性

3、，發(fā)揮其生物學作用。研究顯示Rg1是糖皮質激素受體（GR）的功能性配體，可激活GR。GR屬于核受體超家族，研究結果顯示，小膠質細胞中GR與其配體結合后激活，可通過抑制小膠質細胞的炎性反應，發(fā)揮其對DA能神經元的保護作用。因此本研究第一部分采用SN微量注射脂多糖（LPS）制備去卵巢（OVX）PD炎癥大鼠模型，探討人參皂苷Rg1是否能夠通過GR抑制膠質細胞的炎癥反應，保護中腦黑質DA能神經元。雌激素受體（ER）也是核受體超家族中的一員，其基

4、因組作用是通過經典的核受體ER和ER來介導的。本研究在LPS制備的PD炎癥大鼠模型上，采用腹腔注射阿撲嗎啡（APO）誘導大鼠的旋轉行為，高效液相色譜法（HPLC）檢測大鼠紋狀體（Str）內DA及其代謝產物高香草酸（HVA）和二羥基苯乙酸（DOPAC）的含量變化，免疫組織化學法及免疫熒光觀察黑質DA能神經元的損傷及小膠質細胞的激活情況，硝酸還原酶法（Gress）檢測黑質內NO含量的變化，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）及實時熒光定量PCR技術

5、觀察黑質內炎癥介質的含量及基因表達的變化，免疫印跡技術（western-blot）觀察黑質內酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、GR及炎癥相關信號通路中各種蛋白表達及磷酸化的變化。
　　本研究表明：⑴腹腔注射APO可成功誘導大鼠旋轉行為，旋轉圈數(shù)為9.30圈/分鐘（P<0.001）。給予Rgl（10mg/kg，i.p.）處理之后，其旋轉行為明顯改善，約4.64圈/分鐘，較 LPS組明顯降低（P<0.01

6、），此作用可被 GR阻斷劑 RU486所阻斷（P<0.001）。LPS與RU486共處理對大鼠旋轉行為沒有影響。⑵高效液相結果顯示，LPS模型組患側Str內DA及其代謝產物DOPAC和HVA的含量較對照組明顯下降，分別降低了（72％、64%和70%）（P<0.001）；Rgl處理組患側Str內DA、DOPAC和HVA的含量較LPS組均明顯增加（P<0.05），且此作用可被GR阻斷劑RU486所阻斷（P<0.05）。⑶黑質單側注射LPS導

7、致患側SN致密帶TH免疫反應陽性神經元數(shù)量較健側明顯降低，存活率是健側的36.7%?；紓群谫| TH蛋白表達亦較對照組明顯減少（P<0.001）；給予Rgl處理后，可明顯拮抗LPS誘導的TH免疫反應陽性神經元數(shù)量及蛋白表達的下降（P<0.05），此保護作用可被GR阻斷劑RU486所阻斷（P<0.05）。⑷免疫組化結果證實LPS模型組患側黑質小膠質細胞數(shù)量明顯增多并過度激活，給予Rgl處理后，患側黑質小膠質細胞的數(shù)量及活化程度受到明顯抑制，

8、此抑制作用亦可被GR阻斷劑RU486所阻斷。⑸LPS模型組患側黑質炎癥介質NO、TNF-?及IL-1β的分泌量明顯高于對照組（P<0.001），Rgl處理組患側黑質內NO、TNF-α及IL-1β的含量較LPS組患側明顯減少（P<0.01），此抑制作用可被GR阻斷劑RU486所阻斷。⑹LPS模型組患側與對照組相比，SN區(qū)MAPKs（ERK、JNK、P38）及I?B蛋白的磷酸化水平明顯增加（P<0.01），給予Rgl處理后，可拮抗LPS誘導

9、的MAPKS及I?B蛋白的磷酸化水平的增加（P<0.01），此抑制作用可被GR阻斷劑RU486所阻斷。⑺LPS模型組患側 SN區(qū) GR蛋白表達量較對照組有所下降，但無統(tǒng)計學意義（P>0.05），Rg1處理組患側SN區(qū)GR蛋白表達量較LPS組明顯升高（P<0.05），此作用可被GR阻斷劑RU486所阻斷。⑻Rgl或G1可明顯改善APO誘導的大鼠旋轉行為（P<0.001），此作用可被GPER阻斷劑G15或IGF-IR阻斷劑JB-1所阻斷。⑼

10、Rgl或G1能夠明顯拮抗LPS誘導的患側Str內DA、DOPAC和HVA含量的下降（P<0.05），G15或JB-1與Rg1共處理，能夠明顯抑制Rg1的保護作用。⑽Rgl或G1能夠拮抗LPS誘導的SN致密帶TH免疫反應陽性神經元數(shù)量及蛋白表達的下降（P<0.01），此作用亦可被G15或JB-1所阻斷。⑾免疫熒光結果顯示，LPS誘導的SN區(qū)小膠質細胞的激活，可以被Rg1或G1所拮抗。G15或JB-1與 Rg1共處理，能夠明顯抑制 Rg1的

11、抗炎作用。同時，LPS模型組SN區(qū)致密帶星形膠質細胞的數(shù)量明顯減少，Rg1或G1處理組星形膠質細胞的數(shù)量較LPS組明顯增加，此作用可以被G15或JB-1所阻斷。⑿LPS誘導的黑質內促炎酶（iNOS和COX-2）和炎性因子（TNF-?及IL-1β）的蛋白和基因表達的增加，亦可被Rg1或G1所拮抗（P<0.05）。G15或JB-1與Rg1共處理，能夠明顯抑制Rg1的抗炎作用。⒀Rg1或G1能夠明顯抑制LPS誘導的黑質區(qū)炎癥信號通路（MAPK