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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
最新研究認(rèn)為,成體干細(xì)胞的衰老是生物體衰老的根本原因,因此尋找重新激活衰老干細(xì)胞的方法和調(diào)控它靶向分化對(duì)延緩衰老和防治老年性疾病至關(guān)重要。造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic stem cell/hematopoietic progenitor cell,HSC/HPC)是目前研究最為深入的一種成體干細(xì)胞,現(xiàn)已證明,HSC/HPC衰老與機(jī)體衰老和多種老年性疾病密切相關(guān)。
人參是祖國(guó)醫(yī)學(xué)重要的“補(bǔ)
2、氣”要藥,人參皂苷是人參的主要藥效成分。研究證明:人參皂苷單體Rgl(百nsenoside Rgl)是人參抗衰老的活性成分,它有明顯延長(zhǎng)機(jī)體壽命及細(xì)胞壽命的作用。迄今尚未見(jiàn)從延緩干細(xì)胞衰老角度探討人參抗衰老機(jī)理的報(bào)道。本課題將干細(xì)胞最新的研究技術(shù)與祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的抗衰老理論和對(duì)干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)緊密結(jié)合起來(lái),采用供體HSC/HPC連續(xù)體內(nèi)移植和HSC/HPC體外衰老模型復(fù)制等多種現(xiàn)代生物學(xué)研究手段,從體內(nèi)和體外兩條途徑系統(tǒng)深入地探討人參皂苷單體
3、Rgl延緩HSC/HPC衰老的作用及其可能的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制。旨在為尋找延緩造血干細(xì)胞衰老的方法提供理論指導(dǎo)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
1.免疫磁性分選法(MACS)分離、純化Sca-1+HSC/HPC,流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色和臺(tái)酚藍(lán)染色鑒定分選細(xì)胞性質(zhì)和檢測(cè)細(xì)胞活性;
2.三丁基過(guò)氧化氫(tert-butylhydroperoxide,t-BHP)誘導(dǎo)Sca-1+HSC/HPC衰老,構(gòu)建細(xì)胞衰老體外
4、模型,研究Rgl延緩或治療衰老細(xì)胞的體外生物學(xué)作用;
3.供體Sca-1+HSC/HPC連續(xù)移植給受致死劑量輻射的受體鼠,構(gòu)建細(xì)胞復(fù)制性衰老體內(nèi)模型,觀查移植后受體鼠30天存活率,脾結(jié)節(jié)(CFU-S)形成數(shù)量、脾臟指數(shù)及外周血細(xì)胞(WBC、HCT、PLT)等恢復(fù)情況,PCR檢測(cè)脾集落形成細(xì)胞及受體鼠骨髓細(xì)胞Sry基因表達(dá);研究Rgl延緩或治療衰老細(xì)胞的體內(nèi)生物學(xué)作用;
4.衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-g
5、al)染色、造血祖細(xì)胞混合性集落(CFU-Mix)培養(yǎng)、細(xì)胞周期測(cè)定,觀察Sca-1+HSC/HPC體內(nèi)、外衰老的細(xì)胞生物學(xué)特征;研究Rgl在延緩或治療體內(nèi)、外Sca-1+HSC/HPC衰老的作用機(jī)理;
5.Western blotting和熒光定量PCR檢測(cè)衰老相關(guān)基因p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cipl/WaflmRNA及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P16INK4a、P21Cipl/Wafl、CyclinD1、C
6、yclin E、CDK4、CDK2表達(dá)的改變,觀察體內(nèi)、外模型致Sca-1+HSC/HPC衰老的分子生物學(xué)機(jī)理;研究Rgl延緩或治療Sca-1+HSC/HPC衰老與p16INK4a-Rb和p19Arf-p53-p21Cipl/Wafl信號(hào)通路和信號(hào)分子之間的關(guān)系;
6.Southern blotting與TRAP-PCR法檢測(cè)端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性變化,觀察體內(nèi)、外衰老模型致Sca-1+HSC/HPC衰老及Rgl延緩和治療S
7、ca-1+HSC/HPC衰老與端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性變化的關(guān)系。
結(jié)果:
1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示MACS分選前骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)Sca-1+細(xì)胞百分比為(1.8±1.2)%;MACS分離純化后Sca-1+細(xì)胞純度可達(dá)(87.33±1.25)%。免疫熒光顯示分選前MNCs中僅有(2.7±1.4)%細(xì)胞表達(dá)Sca-1+,MACS分離純化后有(90.86±1.72)%細(xì)胞中達(dá)Sca-1+。臺(tái)盼藍(lán)拒染檢測(cè)分選的
8、Sca-1+細(xì)胞活性為96%~99%。提示分選的Sca-1+細(xì)胞有較高純度和活性。
2.100μmol/L t-BHP作用Sca-1+HSC/HPC6h,細(xì)胞出現(xiàn)衰老的生物學(xué)特征,SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞率提高、G0/G1期細(xì)胞比例增高,形成CFU-Mix集落數(shù)量減少。Rgl延緩或治療體外衰老模型的Sca-1+HSC/HPC后,Sca-1+HSC/HPC的SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞率下降,G0/G0期細(xì)胞比例顯著降低
9、,形成CFU-Mix集落數(shù)量增多;Rgl延緩衰老組各檢測(cè)指標(biāo)均較Rgl治療組變化明顯。
3.Sca-1+HSC/HPC連續(xù)移植三代,PCR檢測(cè)顯示受體鼠脾集落形成細(xì)胞及骨髓細(xì)胞Sry基因表達(dá)陽(yáng)性,提示重建受體鼠造血功能的造血細(xì)胞來(lái)源于雄性供體鼠;隨供體Sca-1+ HSC/HPC移植次數(shù)的增加,受體鼠30天存活率下降,形成CFU-S數(shù)量減少,脾指數(shù)降低,外周血恢復(fù)延緩,Sca-1+HSC/HPC出現(xiàn)細(xì)胞衰老特征,即SA-β
10、-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞率提高、G0/G1期細(xì)胞比例增高,形成CFU-Mix集落數(shù)量減少。Rgl延緩或治療衰老方法處理體內(nèi)衰老的Sca-1+HSC/HPC后,受體鼠30天存活率提高,外周血WBC、HCT和PLT明顯恢復(fù)加快,Sca-1+HSC/HPC的SA-β-Gal染色陽(yáng)性率降低、G0/G1期細(xì)胞比例降低、形成CFU-Mix集落數(shù)量增多;Rgl延緩衰老組各檢測(cè)指標(biāo)均較Rgl治療組變化明顯。
4.t-BHP作用Sca-1+ H
11、SC/HPC6h,Sca-1+HSC/HPC p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cipl/WaflmRNA及P16INK4a、P21cipl/Wafl、CyclinD1蛋白表達(dá)增強(qiáng),Cydin E、CDK4、CDK2蛋白表達(dá)降低。Rgl延緩或治療體外衰老模型的Sca-1+HSCh-IPC后,Sca-1+HSC/HPC p16INK4a、p19Arh、p53、p21Cipl/WaflmRNA及P16INK4a、P21cipl/
12、Wafl、CyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào),CDK4、CDK2、CyclinE表達(dá)上調(diào)。
5.Sca-1+HSC/HPC連續(xù)移植三代,隨移植代數(shù)增加,移植受體鼠Sca-1+HSC/HPC p16INK4a、p19Arf、p53、p21cipl/WaflmRNA及P16INK4a、P21Cipl/Wafl、CyclinD1蛋白表達(dá)增強(qiáng),CDK4、CDK2、CyclinE蛋白表達(dá)水平降低。給予Rgl延緩和治療衰老處理后,Sca-1
13、+HSC/HPC衰老體內(nèi)模型的p16INK4a、p19Arf、p53、p21cipl/WmmRNA及P16INK4a、P21cipl/Waf、CyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào),CDK4、CDK2、CydinE蛋白表達(dá)上調(diào)。
6.體內(nèi)及體外衰老模型中,Sca-1+HSC/HPC端粒長(zhǎng)度縮短加速,端粒酶活性下降。Rgl延緩和治療Sca-1+HSC/HPC衰老體內(nèi)及體外模型后,其端粒長(zhǎng)度縮短減少,端粒酶活性增強(qiáng)。
結(jié)論
14、:
1.采用MACS能成功、有效的分離、純化小鼠Sca-1+HSC/HPC,分離的細(xì)胞活性好,純度高。
2.t-BHP能有效誘導(dǎo)Sca-1+HSC/HPC衰老,可用于構(gòu)建體外HSC/HPC衰老模型。Rgl具有延緩及治療t-BHP誘導(dǎo)的Sca-1+HSC/HPC衰老的作用,Rgl延緩衰老比治療衰老效果更好。
3.Sca-1+HSC/HPC連續(xù)移植受體三次,能成功構(gòu)建HSC/HPC體內(nèi)衰老模型。Rg
15、l具有延緩及治療連續(xù)移植過(guò)程中Sca-1+HSC/HPC衰老的作用,Rgl延緩衰老比治療衰老效果更好。
4.p16INK4a-Rb、p19Arf-p53-p21Cipl/Wafl信號(hào)通路在Sca-1+HSC/HPC衰老及Rgl延緩或治療Sca-1+HSC/HPC衰老中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。
5.端粒長(zhǎng)度縮短和端粒酶活性下降可能是Sca-1+HSC/HPC衰老的機(jī)制之一;Rgl可能通過(guò)激活端粒酶活性和減少端粒長(zhǎng)
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