人參皂苷Rg1調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路延緩造血干-祖細胞衰老的機制研究.pdf

1、目的：干細胞衰老是機體衰老的關(guān)鍵因素和最新學說，調(diào)控干細胞衰老對探討衰老生物學機理與防治老年性疾病尤為重要。造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）衰老特征主要表現(xiàn)為自我更新能力衰退及分化功能異常，其表現(xiàn)主要是貧血、白血病、免疫力低下、骨髓造血抑制等衰老相關(guān)性疾病。
　　人參是中醫(yī)傳統(tǒng)的“補氣”中藥，人參皂苷 Rg1是其主要的藥物活性成分，有廣泛的藥理作用，具有提高記憶力、增強免疫力、抗腫瘤和促進細

2、胞修復等作用。本課題組前期研究證明，人參皂苷Rg1具有調(diào)控造血干/祖細胞（HSC/HPCs）衰老的作用，但其分子機制尚不清楚，值得深入探討。本研究將干細胞衰老的最新技術(shù)理論與祖國傳統(tǒng)的抗衰老醫(yī)學緊密結(jié)合，分別構(gòu)建HSC/HPCs體外、體內(nèi)衰老模型，研究人參皂苷Rg1延緩HSC/HPCs衰老與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系，深入闡釋Rg1延緩HSC/HPCs衰老的分子機理，對弘揚祖國傳統(tǒng)醫(yī)學的“氣血理論”有重要學科價值，對尋

3、找延緩或治療 HSC/HPCs衰老的分子作用靶點有重要意義。
　　方法：
　　1.小鼠造血干/祖細胞的分選：免疫磁珠分選法（MACS）分離提取、純化小鼠骨髓中Sca-1+HSC/HPCs，流式細胞術(shù)鑒定細胞表型和臺盼藍染色測細胞活力。
　　2.氧化低密度脂蛋白（oxidation low density lipoprotein,ox-LDL）誘導Sca-1+HSC/HPCs的體外衰老模型，實驗分為五組：對照組;ox-L

4、DL衰老組；ox-LDL+Rg1組；ox-LDL+DKK1組；ox-LDL+NAC組。研究Rg1體外調(diào)控細胞衰老的生物學作用。
　　3. D-半乳糖(D-gal,120mg/kg-d)連續(xù)皮下注射誘導小鼠衰老，建立小鼠Sca-1+HSC/HPCs的體內(nèi)衰老模型，實驗分為四組：對照組；D-gal衰老模型組；D-gal+Rg1組；D-gal+VitE組。研究Rg1體內(nèi)調(diào)控細胞衰老的生物學作用。
　　4.衰老相關(guān)指標檢測：衰老相關(guān)

5、β-半乳糖苷酶染色（SA-β-Gal）、造血祖細胞混合集落培養(yǎng)（CFU-Mix）、細胞周期分析。觀察體內(nèi)、外模型中Sca-1+HSC/HPCs的衰老生物學特征；研究Rg1延緩Sca-1+HSC/HPCs衰老的作用。
　　5.氧化應激相關(guān)指標檢測：ROS水平，經(jīng)免疫熒光和流式細胞術(shù)檢測；T-AOC、SOD、GSH-Px及MDA含量檢測；Western blot檢測4-HNE水平；ELISA法檢測8-OHdG和AGEs含量。觀察體內(nèi)、

6、外模型中Sca-1+HSC/HPCs的氧化應激反應情況；探討Rg1延緩Sca-1+HSC/HPCs衰老與調(diào)控氧化應激的關(guān)系。
　　6.經(jīng)典Wnt信號通路相關(guān)蛋白基因檢測：Western blot分別檢測胞質(zhì)β-catenin、胞核β-catenin、TCF-4、GSK-3β、Phospho-GSK-3β蛋白表達；免疫熒光檢測β-catenin、Phospho-GSK-3β蛋白在細胞中的定位表達；實時熒光定量PCR檢測β-caten

7、in、c-myc mRNA表達。觀察體內(nèi)、外模型中Sca-1+HSC/HPCs衰老時Wnt/β-catenin信號通路情況；探討Rg1延緩Sca-1+HSC/HPCs衰老與Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系。NAC和VitE的采用旨在研究Wnt/β-catenin信號通路與氧化應激之間的關(guān)系。
　　7.衰老相關(guān)途徑蛋白基因檢測：Western blot分別檢測p53、p21Cip1/Waf1、p16Ink4a、Rb和r-H2

8、A.X蛋白表達；實時熒光定量PCR檢測p21Cip1/Waf1、p16Ink4a表達。觀察體內(nèi)、外模型中Sca-1+HSC/HPCs衰老時DNA損傷反應、p16Ink4a-Rb和p53-p21Cip1/Waf1通路情況；探討Rg1延緩Sca-1+HSC/HPCs衰老與 DNA損傷反應、p16Ink4a-Rb和p53-p21Cip1/Waf1通路之間的關(guān)系。DKK1的采用旨在研究Wnt/β-catenin信號通路與DNA損傷反應、p16I

9、nk4a-Rb和p53-p21Cip1/Waf1通路之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.采用MACS法分離純化后Sca-1+HSC/HPCs的純度達到90.08±2.7%。其比例明顯高于分選前MNCs中Sca-1+HSC/HPCs細胞百分比（7.57±1.38%）。并且經(jīng)臺盼藍染色法檢測Sca-1+HSC/HPCs存活率為95%～98%。提示運用MACS法分離純化Sca-1+HSC/HPCs可保持其較高的純度與活性。
　

10、　2.ox-LDL作用Sca-1+HSC/HPCs后，細胞表現(xiàn)出衰老生物學特征，SA-β-Gal染色陽性細胞百分比明顯增高，細胞處于G0/G1期增多、S期比例減少，CFU-Mix集落形成數(shù)量明顯減少。細胞ROS水平明顯增高，細胞培養(yǎng)上清液中SOD、GSH-Px活性明顯降低，MDA含量增加。無論是在Sca-1+HSC/HPCs的胞質(zhì)還是胞核中β-catenin表達均顯著上調(diào)，且胞核內(nèi)的增多更為明顯；β-catenin、c-myc mRNA

11、表達水平也增高；GSK-3β磷酸化水平明顯上升；TCF-4、4-HNE、p53、p21Cip1/Waf1、p16Ink4a、Rb蛋白和p21Cip1/Waf1、p16Ink4a mRNA表達均明顯上調(diào)；細胞r-H2A.X蛋白表達和培養(yǎng)上清中8-OHdG含量也明顯增加。
　　3.人參皂苷Rg1體外作用于ox-LDL處理的Sca-1+HSC/HPCs后，使其SA-β-Gal染色陽性細胞百分比明顯降低，G1期比例降低、S期比例有所升高，

12、CFU-Mix數(shù)量增多。細胞ROS水平有所降低，細胞培養(yǎng)上清液中SOD、GSH-Px活性增加，MDA含量下降。無論是在Sca-1+HSC/HPCs的胞質(zhì)還是胞核中β-catenin表達均有所下降，β-catenin、c-myc mRNA表達水平也降低；GSK-3β磷酸化水平有所下降；TCF-4、4-HNE、p53、p21Cip1/Waf1、p16Ink4a、Rb蛋白和p21Cip1/Waf1、p16Ink4a mRNA表達均下調(diào)；細胞r

13、-H2A.X蛋白表達和培養(yǎng)上清中8-OHdG含量也有所減少。DKK1或NAC加入處理也能不同程度拮抗ox-LDL誘導的細胞中多個信號通路分子的變化。
　　4.D-半乳糖(D-gal,120 mg/kg-+d)連續(xù)皮下注射誘導小鼠衰老模型，小鼠Sca-1+HSC/HPCs表現(xiàn)衰老生物學特點。SA-β-Gal染色陽性率明顯上升而CFU-Mix集落形成數(shù)量明顯下降。細胞ROS水平明顯增高而T-AOC水平降低，小鼠血清中MDA含量顯著升高

14、而SOD、GSH-Px活性明顯下降。Sca-1+HSC/HPCs的細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的β-catenin表達明顯增強，β-catenin、c-myc mRNA水平明顯上調(diào)；pGSK-3β水平明顯增高且細胞質(zhì)中表達增強；r-H2A.X蛋白表達和血清中8-OHdG、AGEs含量明顯增多；小鼠的Sca-1+HSC/HPCs中p16Ink4a、Rb、p53、p21Cip1/Waf1、TCF-4、4-HNE蛋白及p21Cip1/Waf1、p16In

15、k4a mRNA表達也明顯上調(diào)。
　　5.人參皂苷Rg1體內(nèi)作用于D-gal處理的小鼠Sca-1+HSC/HPCs后，使其SA-β-Gal染色陽性率降低而CFU-Mix集落形成數(shù)量有所上升。細胞ROS水平下降而T-AOC水平回升，小鼠血清中MDA含量降低而SOD、GSH-Px活性增高。Sca-1+HSC/HPCs的胞質(zhì)和胞核內(nèi)的β-catenin表達有所下降，β-catenin、c-myc mRNA水平下調(diào)；pGSK-3β水平降低

16、且細胞質(zhì)中表達減弱；r-H2A.X蛋白表達和血清中8-OHdG、AGEs含量有所減少；p16Ink4a、Rb、p53、p21Cip1/Waf1、TCF-4、4-HNE蛋白及p21Cip1/Waf1、p16Ink4a mRNA表達也有所降低。VitE加入處理也能一定程度拮抗D-ga l體內(nèi)誘導的細胞中多個信號通路分子的變化，但其作用效果弱于Rg1。
　　結(jié)論：
　　1.ox-LDL可用于建立Sca-1+HSC/HPCs體外衰老

17、的細胞模型。其作用機制與ox-LDL誘導氧化應激和調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。
　　2.D-gal的連續(xù)皮下注射可以誘導模型小鼠Sca-1+HSC/HPCs衰老發(fā)生，可作為Sca-1+HSC/HPCs衰老研究的體內(nèi)模型。其作用機制與D-gal誘導氧化應激和調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。
　　3.DNA損傷反應、p16Ink4a-Rb和p53-p21Cip1/Waf1通路是氧化應激或Wnt/β-c

18、atenin信號通路介導細胞衰老的途徑。
　　4.人參皂苷Rg1體外作用可通過調(diào)控ROS介導的Wnt/β-catenin信號通路，進一步下調(diào) DNA損傷反應、p16Ink4a-Rb和p53-p21Cip1/Waf1通路，從而拮抗ox-LDL誘導的Sca-1+HSC/HPCs衰老。
　　5.人參皂苷Rg1體內(nèi)作用可調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，并且阻遏氧化應激介導的DNA損傷反應、p16Ink4a-Rb和p53-p2