Wnt與Notch信號通路調控造血發(fā)育機制研究.pdf

1、目的：研究在造血發(fā)育過程中不同階段不同部位，c-kit+造血祖細胞中Wnt和Notch信號通路中各成分的時空表達變化。
　　 方法：用免疫磁珠陽性分離法分離小鼠孕10.5天(E10.5)、E11.5 AGM區(qū)，E12.5、E14.5、E16.5、E18胎肝(Fetal liver，FL)和成體骨髓(Bone marrow，BM)來源的c-kit陽性造血祖細胞，流式細胞術檢測其分選純度。實時定量PCR檢測以上時間點和部位分選的造血

2、祖細胞中Wnt信號通路成員(wnt3a，wnt5a，wnt10b，Frizzled3，Frizzled4，Frizzled7，c-myc，ccnb1)和Notch信號通路成員（notch1，notch2，notch3，notch4，jagged1，hes1）的基因表達變化，免疫熒光染色法分別鑒定E10.5 AGM區(qū)，E14.5 FL以及BM來源的c-kit+細胞中WNT3a和NOTCH1蛋白的表達。將E10.5 AGM區(qū)，E14.5 F

3、L以及BM來源的c-kit+細胞體外培養(yǎng)7天，檢測其增殖、分化以及集落形成能力。
　　 結果：免疫磁珠陽性選擇法分選的c-kit+細胞，純度可達90％以上。Wnt和Notch信號通路基因在各發(fā)育階段的c-kit+造血祖細胞均有表達。其中，Wnt和Notch信號通路成員基因在AGM區(qū)來源的c-kit+造血祖細胞中均高表達；胎肝來源c-kit+造血祖細胞中Notch通路基因表達水平較低，明顯低于AGM區(qū)和骨髓來源c-kit+造血祖細

4、胞的表達；而骨髓來源的c-kit+造血祖細胞中Wnt通路基因表達水平較低，明顯低于AGM區(qū)和FL來源c-kit+造血祖細胞的表達（P＜0.05）。免疫熒光染色顯示，在AGM區(qū)，FL和BM來源的c-kit+細胞中，WNT3a和NOTCH1蛋白均有不同程度的表達。E10.5 AGM區(qū)內WNT3a和NOTCH1蛋白表達最高。與AGM區(qū)以及骨髓相比，FL來源的c-kit+細胞NOTCH1蛋白的表達較低。與胎肝相比，骨髓來源的細胞WNT3a的表達

5、明顯降低而NOTCH1蛋白的表達明顯升高（P＜0.05）。體外培養(yǎng)7天后，AGM區(qū)和胎肝來源細胞具有較強的增殖能力，胎肝來源細胞易于分化，而骨髓來源細胞易于維持其未分化狀態(tài)。在體外集落形成能力方面，AGM 區(qū)來源 c-kit+細胞具有較強的形成混合集落形成單位(CFU-Mix)的能力；而FL、BM 來源c-kit+細胞則能形成更多粒單系集落形成單位(CFU-GM)。
　　 結論：造血發(fā)育過程中，不同發(fā)育階段的造血祖細胞的Wnt和