大鼠視網(wǎng)膜Muller細胞的神經(jīng)干細胞特性及其Wnt和Notch信號通路調控機制的研究.pdf

1、目的：
　　 1.對視網(wǎng)膜Müller細胞的原代培養(yǎng)方法加以改良,建立簡單快捷的分離培養(yǎng)Müller細胞的方法。
　　 2.通過體外去分化誘導,探討大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞干細胞潛能的激活條件及調控機制。
　　 3.研究Wnt和Notch信號通路在Müller細胞去分化的調控作用。
　　 方法：
　　 1.取新生5—7天SD大鼠,顯微鏡下分離視網(wǎng)膜,直接吹打成微小組織懸液后置于含10％胎牛血清(

2、fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基中培養(yǎng),8-10天后行第一次換液,之后2-3天換液一次至細胞完全融合后進行傳代。免疫熒光組織化學檢測Müller細胞標志物谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)和波形蛋白(Vimentin)的表達進行細胞鑒定,使用FACS對所得細胞進行純度檢測。
　　 2.取第3代視網(wǎng)膜Müller細胞,更換含DMEM/F12(1:1.),

3、1×N2 supplement,2× B27 supplement,20 ng/ml表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF),10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的無血清去分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3-5天。倒置相差顯微鏡下觀察去分化后細胞的形態(tài)特征,免疫熒光組織化學,Real time RT-PCR以及Western blotting檢測神經(jīng)干

4、細胞標志物Nestin,Musashi-1以及視網(wǎng)膜干細胞標志物Pax6的表達情況。CCK-8法檢測去分化后細胞的增殖能力。更換含1×N2 supplement,2×B27 supplement,10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基對去分化后的細胞進行再分化誘導,免疫熒光組織化學檢測膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達情況。
　　 3.Real time RT-PCR

5、檢測Wnt和Notch信號通路的相關分子Fzd1,Fzd2,Lef1,Notch1,Delta1和Hes1在Müller細胞去分化培養(yǎng)前后的mRNA水平,并于去分化培養(yǎng)的第0,1,2,3,4,5天分別收集細胞行Western blotting檢測Wnt2,β-catenin,Notch1,Pax6和Nestin的蛋白水平。
　　 4.使用通路激動劑(Wnt-3a,Notch1)和抑制劑(Dkk-1,DAPT)對Müller去分化

6、培養(yǎng)過程中的Wnt和Notch信號通路進行干預,觀察Müller細胞去分化的情況,FACS檢測各組去分化前后視網(wǎng)膜干細胞標志物Pax6陽性細胞的百分率。CCK-8檢測各組中神經(jīng)球細胞的自我增殖能力。
　　 結果:
　　 1.原代培養(yǎng)的Müller細胞胞體狹長,胞漿豐富,免疫熒光檢測結果顯示,97.2±1.43％的細胞GS染色陽性,90.3±2.17％的細胞Vimentin染色陽性。流式細胞檢測顯示傳3代后的細胞99.7％

7、GS表達陽性。
　　 2.去分化培養(yǎng)3—5天后,大部分Müller細胞克隆生長成神經(jīng)球狀,免疫熒光組織化學檢測顯示,細胞球Nestin,Musashi-1及Pax6染色陽性。Real time RT-PCR的結果顯示,細胞球中Pax6的mRNA水平較Müller細胞增加了～5.57倍,Nestin的mRNA水平增加了～3.98倍,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。Western blotting結果顯示,神經(jīng)球細胞中的Pax6和

8、Nestin的蛋白表達水平較Müller細胞有明顯升高。FACS結果顯示,去分化前的Müller細胞中Pax6和Nestin的陽性率分別為7.8％和7.3％,去分化后的細胞為80.2％和60.4％。CCK-8檢測顯示,神經(jīng)球細胞可以自我增殖,同時經(jīng)再分化誘導培養(yǎng)后表達膠質細胞標志物GFAP。
　　 3.Real time RT-PCR結果顯示,神經(jīng)球細胞中Wnt和Notch通路相關基因的mRNA水平較Müller細胞明顯升高,其

9、中Fzd1為～2.44倍,Fzd2為～2.82倍,Lef1為～4.62倍,Notch1為～3.24倍,Delta1為～2.64倍,Hes1為～5.71倍,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。Western blotting結果顯示,從d0到d5,Wnt2,β-catenin,Notch1,Pax6和Nestin蛋白的表達逐漸增強,通路相關蛋白Wnt2,β-catenin及Notch1與干細胞標志物Pax6及Nestin的表達存在時間的一

10、致性。
　　 4.在添加Wnt-3a和Notch1組中,神經(jīng)球的數(shù)量明顯增加,體積增大,添加Dkk-1和DAPT組中,神經(jīng)球數(shù)量較少,細胞增殖緩慢。FACS結果顯示,在Wnt-3a+Notch1組中,Pax6陽性的細胞為94.1％,Wnt-3a組中為87.1％,Notch1組中為76.2％,均較對照組的63.7％有所升高,在Dkk-1組中Pax6陽性細胞為38.4％,DAPT組中為31.7％,均較對照組明顯下降。CCK-8檢測結

11、果顯示,在Wnt-3a+Notch1組,Wnt-3a組和Notch1組中,細胞增殖速度均較對照組快,在Dkk-1組和DAPT組中,細胞增殖速度較對照組下降。
　　 結論:
　　 1.改良后的培養(yǎng)方法可以簡單快捷的分離純化視網(wǎng)膜Müller細胞。
　　 2.生長因子的刺激可以在體外激活視網(wǎng)膜Müller細胞的干細胞特性,Müller細胞很可能成為視網(wǎng)膜干細胞的一種潛在來源。
　　 3.Müller細胞去分化