基于Shh、Wnt信號(hào)通路的造血調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)課題以Balb/c小鼠的胚胎主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephros region, AGM region)，胎肝(fetAlliver, FL)以及小鼠骨髓(bone marrow, BM)為研究對(duì)象，研究Shh、Wnt信號(hào)通路調(diào)控不同發(fā)育階段、不同造血部位來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞生物學(xué)特性的時(shí)空變化。
　　 方法：采用磁珠分選法分離Balb/c小鼠孕10.5

2、天 （E10.5）AGM區(qū)、E14.5 FL以及BM來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)小鼠E14.5 FL來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠胚胎AGM區(qū)(E10.5, E11.5)、FL (E12.5, E14.5, E16.5, E18)以及BM來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞中c-kit+造血祖細(xì)胞的所占比例。建立體外以FL來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞為飼養(yǎng)層的Transwell共培養(yǎng)體系，比較在基質(zhì)細(xì)胞支持造血的培養(yǎng)條件下，不同來(lái)源的c-kit+造

3、血祖細(xì)胞體外增殖、遷移以及集落形成能力。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于BM，E10.5 AGM區(qū)和E12.5 FL中c-kir+造血祖細(xì)胞所占比例較高。通過(guò)體外集落形成能力分析，AGM區(qū)來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞具有較強(qiáng)的形成混合集落形成單位(CFU-Mix)集落的能力；FL、BM來(lái)源c-kit+細(xì)胞則形成更多粒單系集落形成單位(CFU-GM)集落。進(jìn)行體外Transwell共培養(yǎng)，AGM區(qū)來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞

4、具有較強(qiáng)的增殖潛能，骨髓來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞的增殖能力最弱；AGM區(qū)和FL來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞比BM來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞在體外培養(yǎng)中具有更強(qiáng)的趨化遷移能力。
　　 結(jié)論：和FL、BM來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞相比，AGM區(qū)來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外增殖和趨化遷移能力，在未來(lái)可能有著更廣闊的應(yīng)用前景。
　　 第二部分
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)課題以Balb/c小鼠的不同發(fā)育階段的胚

5、胎主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(AGM region)，胎肝(FL)以及小鼠骨髓(BM)為研究對(duì)象，研究Shh、Wnt信號(hào)通路調(diào)控不同發(fā)育階段、不同造血部位來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞生物學(xué)特性的時(shí)空變化。
　　 方法：采用磁珠分選法分離Balb/c小鼠AGM區(qū)（孕10.5天、孕11.5天） （E10.5、E11.5）、FL（E12.5、E14.5、E16.5、E18）以及BM來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞。用實(shí)時(shí)定量PCR的方法（Real

6、-time PCR）檢測(cè)Shh、Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因Shh、Wnt3a在不同來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。用免疫熒光檢測(cè)Shh蛋白和Wnt3a蛋白在造血組織及c-kit+造血祖細(xì)胞中的表達(dá)。體外培養(yǎng)骨髓來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)體系進(jìn)行不同干預(yù)分組：（1）對(duì)照組；（2）Shh組（0.5 ug/ml）；（3）cyclopamine（Shh通路抑制劑）組（0.5 ug/ml）；（4）Shh+cyclopamine組；通

7、過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)以及集落培養(yǎng)，比較Shh調(diào)控下c-kit+造血祖細(xì)胞的增殖能力。
　　 結(jié)果：Shh和Wnt信號(hào)通路在造血發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)著動(dòng)態(tài)變化。 Shh、Wnt3a在胚胎E10.5 AGM的c-kit+造血祖細(xì)胞中有較高表達(dá)，而在骨髓來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞中的表達(dá)則最弱。骨髓c-kit+造血祖細(xì)胞的體外增殖可被Shh通路拮抗劑cyclopamine抑制。外源性的Shh肽可以明顯促進(jìn)骨髓c-kit+造血祖細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋

8、白Cyclin D1表達(dá)增高，Wnt信號(hào)通路上下游靶基因wnt3a、wnt5a、c-myc表達(dá)增高；而在cyclopamine（0.5 ug/ml）的作用下，外源肽Shh對(duì)Wnt信號(hào)通路以及細(xì)胞增殖的活化作用均可被阻斷。
　　 結(jié)論：我們的研究發(fā)現(xiàn)，c-kit+造血祖細(xì)胞的體外增殖能力可能與其自身的Shh、Wnt信號(hào)通路的活化程度有關(guān)。Shh信號(hào)通路可通過(guò)促進(jìn)Wnt信號(hào)通路活化，從而參與調(diào)控造血祖細(xì)胞增殖。
　　 第三部

9、分
　　 目的：以小鼠胚胎孕10.5 d（E10.5）AGM區(qū)，E12.5、E14.5胎肝以及小鼠骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，探討造血發(fā)育過(guò)程中Shh和Wnt信號(hào)通路參與造血微環(huán)境調(diào)控造血祖細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　　 方法：磁珠分選法分離小鼠骨髓來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞。貼壁培養(yǎng)法分離小鼠E10.5 AGM區(qū)、E12.5、E14.5胎肝以及骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞。建立體外以基質(zhì)細(xì)胞為飼養(yǎng)層的Transwell共培養(yǎng)體系，通

10、過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，比較不同來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞支持造血的能力。通過(guò)Real-time PCR和免疫熒光動(dòng)態(tài)檢測(cè)各個(gè)發(fā)育階段來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞中Shh、Wnt信號(hào)通路基因及蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：體外培養(yǎng)7天，AGM區(qū)來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中c-kit+造血祖細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)了近50倍，胎肝來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中c-kit+造血祖細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)了(60-80)倍，均明顯高于以骨髓基質(zhì)細(xì)胞為飼養(yǎng)層的Transwell共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞增長(zhǎng)量(22.9±

11、4.5)倍（P＜0.05）。AGM區(qū)、胎肝、骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)Shh、Wnt3a、Wnt5a。Shh和Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育過(guò)程中更為活化。Shh在AGM區(qū)來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)是骨髓來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞的（3.4±0.45）倍，在胎肝來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)是骨髓來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量的（11.8±2.3）倍（P＜0.05）。Wnt3a和Wnt5a在E10.5 AGM區(qū)來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞中的基因表達(dá)量是骨髓來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞的（13.6±2.1）倍，

12、隨著胚胎發(fā)育，wnt3a和wnt5a的表達(dá)逐漸下降，在E14.5胎肝來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)亦再次增高，為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的（9.56±1.14）倍（P＜0.05）。免疫熒光提示Shh蛋白在胚胎期明顯高表達(dá)，尤其是在胎肝。Wnt信號(hào)通路的核心轉(zhuǎn)錄分子β-catenin蛋白在不同來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞中具有表達(dá)，其中以胚胎期E10.5 AGM區(qū)以及E14.5胎肝來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度最高，并且具有明顯的核內(nèi)累積現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：造血發(fā)育過(guò)程中，

13、造血微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)Shh與Wnt信號(hào)通路協(xié)作、交替、整合作用，精密調(diào)控造血祖細(xì)胞的增殖。
　　 第四部分
　　 目的：探索Shh、Wnt信號(hào)通路調(diào)控c-kit+造血祖細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　　 方法：c-kit抗體偶聯(lián)磁珠分選法分離小鼠骨髓來(lái)源的造血祖細(xì)胞。采用貼壁培養(yǎng)法分離小鼠孕14.5d (E14.5)胎肝來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞。將E14.5胎肝基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，與c-kit+造血祖細(xì)進(jìn)行Transwell共培養(yǎng)

14、體，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制c-kit+造血祖細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。對(duì)體外Transwell共培養(yǎng)的c-kit+造血祖細(xì)胞進(jìn)行不同干預(yù)分組：（1）對(duì)照組；（2）Shh處理組（0.5 ug/ml）；（3）cyclopamine處理組（Shh通路抑制劑）（0.5 ug/ml）；（4）Shh+cyclopamine處理組；通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)以及集落培養(yǎng)，比較不同培養(yǎng)條件下c-kit+造血祖細(xì)胞增殖的能力。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)Shh調(diào)控下Wnt信號(hào)通路

15、的核心分子Wnt3a、Wnt5a、信號(hào)通路靶基因c-myc以及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1的表達(dá)。
　　 結(jié)果：E14.5胎肝來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞可明顯促進(jìn)骨髓c-kit+造血祖細(xì)胞增殖。Transwell培養(yǎng)體系中骨髓c-kit+造血祖細(xì)胞的增殖效應(yīng)可被Shh通路拮抗劑cyclopamine抑制。在Transwell共培養(yǎng)體系中，外源性的Shh肽可以明顯促進(jìn)c-kit+造血祖細(xì)胞增殖，Wnt信號(hào)通路上下游靶基因wnt3a、wnt5