基于Shh、Wnt信號(hào)通路的造血調(diào)控機(jī)制研究.pdf_第1頁(yè)
已閱讀1頁(yè),還剩82頁(yè)未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、第一部分
   目的:本實(shí)驗(yàn)課題以Balb/c小鼠的胚胎主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephros region, AGM region),胎肝(fetAlliver, FL)以及小鼠骨髓(bone marrow, BM)為研究對(duì)象,研究Shh、Wnt信號(hào)通路調(diào)控不同發(fā)育階段、不同造血部位來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞生物學(xué)特性的時(shí)空變化。
   方法:采用磁珠分選法分離Balb/c小鼠孕10.5

2、天 (E10.5)AGM區(qū)、E14.5 FL以及BM來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞,貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)小鼠E14.5 FL來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠胚胎AGM區(qū)(E10.5, E11.5)、FL (E12.5, E14.5, E16.5, E18)以及BM來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞中c-kit+造血祖細(xì)胞的所占比例。建立體外以FL來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞為飼養(yǎng)層的Transwell共培養(yǎng)體系,比較在基質(zhì)細(xì)胞支持造血的培養(yǎng)條件下,不同來(lái)源的c-kit+造

3、血祖細(xì)胞體外增殖、遷移以及集落形成能力。
   結(jié)果:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn):相對(duì)于BM,E10.5 AGM區(qū)和E12.5 FL中c-kir+造血祖細(xì)胞所占比例較高。通過(guò)體外集落形成能力分析,AGM區(qū)來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞具有較強(qiáng)的形成混合集落形成單位(CFU-Mix)集落的能力;FL、BM來(lái)源c-kit+細(xì)胞則形成更多粒單系集落形成單位(CFU-GM)集落。進(jìn)行體外Transwell共培養(yǎng),AGM區(qū)來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞

4、具有較強(qiáng)的增殖潛能,骨髓來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞的增殖能力最弱;AGM區(qū)和FL來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞比BM來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞在體外培養(yǎng)中具有更強(qiáng)的趨化遷移能力。
   結(jié)論:和FL、BM來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞相比,AGM區(qū)來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外增殖和趨化遷移能力,在未來(lái)可能有著更廣闊的應(yīng)用前景。
   第二部分
   目的:本實(shí)驗(yàn)課題以Balb/c小鼠的不同發(fā)育階段的胚

5、胎主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(AGM region),胎肝(FL)以及小鼠骨髓(BM)為研究對(duì)象,研究Shh、Wnt信號(hào)通路調(diào)控不同發(fā)育階段、不同造血部位來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞生物學(xué)特性的時(shí)空變化。
   方法:采用磁珠分選法分離Balb/c小鼠AGM區(qū)(孕10.5天、孕11.5天) (E10.5、E11.5)、FL(E12.5、E14.5、E16.5、E18)以及BM來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞。用實(shí)時(shí)定量PCR的方法(Real

6、-time PCR)檢測(cè)Shh、Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因Shh、Wnt3a在不同來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。用免疫熒光檢測(cè)Shh蛋白和Wnt3a蛋白在造血組織及c-kit+造血祖細(xì)胞中的表達(dá)。體外培養(yǎng)骨髓來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞,對(duì)培養(yǎng)體系進(jìn)行不同干預(yù)分組:(1)對(duì)照組;(2)Shh組(0.5 ug/ml);(3)cyclopamine(Shh通路抑制劑)組(0.5 ug/ml);(4)Shh+cyclopamine組;通

7、過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)以及集落培養(yǎng),比較Shh調(diào)控下c-kit+造血祖細(xì)胞的增殖能力。
   結(jié)果:Shh和Wnt信號(hào)通路在造血發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)著動(dòng)態(tài)變化。 Shh、Wnt3a在胚胎E10.5 AGM的c-kit+造血祖細(xì)胞中有較高表達(dá),而在骨髓來(lái)源c-kit+造血祖細(xì)胞中的表達(dá)則最弱。骨髓c-kit+造血祖細(xì)胞的體外增殖可被Shh通路拮抗劑cyclopamine抑制。外源性的Shh肽可以明顯促進(jìn)骨髓c-kit+造血祖細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞周期蛋

8、白Cyclin D1表達(dá)增高,Wnt信號(hào)通路上下游靶基因wnt3a、wnt5a、c-myc表達(dá)增高;而在cyclopamine(0.5 ug/ml)的作用下,外源肽Shh對(duì)Wnt信號(hào)通路以及細(xì)胞增殖的活化作用均可被阻斷。
   結(jié)論:我們的研究發(fā)現(xiàn),c-kit+造血祖細(xì)胞的體外增殖能力可能與其自身的Shh、Wnt信號(hào)通路的活化程度有關(guān)。Shh信號(hào)通路可通過(guò)促進(jìn)Wnt信號(hào)通路活化,從而參與調(diào)控造血祖細(xì)胞增殖。
   第三部

9、分
   目的:以小鼠胚胎孕10.5 d(E10.5)AGM區(qū),E12.5、E14.5胎肝以及小鼠骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象,探討造血發(fā)育過(guò)程中Shh和Wnt信號(hào)通路參與造血微環(huán)境調(diào)控造血祖細(xì)胞增殖的機(jī)制。
   方法:磁珠分選法分離小鼠骨髓來(lái)源的c-kit+造血祖細(xì)胞。貼壁培養(yǎng)法分離小鼠E10.5 AGM區(qū)、E12.5、E14.5胎肝以及骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞。建立體外以基質(zhì)細(xì)胞為飼養(yǎng)層的Transwell共培養(yǎng)體系,通

10、過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù),比較不同來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞支持造血的能力。通過(guò)Real-time PCR和免疫熒光動(dòng)態(tài)檢測(cè)各個(gè)發(fā)育階段來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞中Shh、Wnt信號(hào)通路基因及蛋白的表達(dá)水平。
   結(jié)果:體外培養(yǎng)7天,AGM區(qū)來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中c-kit+造血祖細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)了近50倍,胎肝來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中c-kit+造血祖細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)了(60-80)倍,均明顯高于以骨髓基質(zhì)細(xì)胞為飼養(yǎng)層的Transwell共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞增長(zhǎng)量(22.9±

11、4.5)倍(P<0.05)。AGM區(qū)、胎肝、骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)Shh、Wnt3a、Wnt5a。Shh和Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育過(guò)程中更為活化。Shh在AGM區(qū)來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)是骨髓來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞的(3.4±0.45)倍,在胎肝來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)是骨髓來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量的(11.8±2.3)倍(P<0.05)。Wnt3a和Wnt5a在E10.5 AGM區(qū)來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞中的基因表達(dá)量是骨髓來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞的(13.6±2.1)倍,

12、隨著胚胎發(fā)育,wnt3a和wnt5a的表達(dá)逐漸下降,在E14.5胎肝來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)亦再次增高,為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的(9.56±1.14)倍(P<0.05)。免疫熒光提示Shh蛋白在胚胎期明顯高表達(dá),尤其是在胎肝。Wnt信號(hào)通路的核心轉(zhuǎn)錄分子β-catenin蛋白在不同來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞中具有表達(dá),其中以胚胎期E10.5 AGM區(qū)以及E14.5胎肝來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度最高,并且具有明顯的核內(nèi)累積現(xiàn)象。
   結(jié)論:造血發(fā)育過(guò)程中,

13、造血微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)Shh與Wnt信號(hào)通路協(xié)作、交替、整合作用,精密調(diào)控造血祖細(xì)胞的增殖。
   第四部分
   目的:探索Shh、Wnt信號(hào)通路調(diào)控c-kit+造血祖細(xì)胞增殖的機(jī)制。
   方法:c-kit抗體偶聯(lián)磁珠分選法分離小鼠骨髓來(lái)源的造血祖細(xì)胞。采用貼壁培養(yǎng)法分離小鼠孕14.5d (E14.5)胎肝來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞。將E14.5胎肝基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,與c-kit+造血祖細(xì)進(jìn)行Transwell共培養(yǎng)

14、體,通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制c-kit+造血祖細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。對(duì)體外Transwell共培養(yǎng)的c-kit+造血祖細(xì)胞進(jìn)行不同干預(yù)分組:(1)對(duì)照組;(2)Shh處理組(0.5 ug/ml);(3)cyclopamine處理組(Shh通路抑制劑)(0.5 ug/ml);(4)Shh+cyclopamine處理組;通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)以及集落培養(yǎng),比較不同培養(yǎng)條件下c-kit+造血祖細(xì)胞增殖的能力。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)Shh調(diào)控下Wnt信號(hào)通路

15、的核心分子Wnt3a、Wnt5a、信號(hào)通路靶基因c-myc以及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1的表達(dá)。
   結(jié)果:E14.5胎肝來(lái)源基質(zhì)細(xì)胞可明顯促進(jìn)骨髓c-kit+造血祖細(xì)胞增殖。Transwell培養(yǎng)體系中骨髓c-kit+造血祖細(xì)胞的增殖效應(yīng)可被Shh通路拮抗劑cyclopamine抑制。在Transwell共培養(yǎng)體系中,外源性的Shh肽可以明顯促進(jìn)c-kit+造血祖細(xì)胞增殖,Wnt信號(hào)通路上下游靶基因wnt3a、wnt5

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論