人參皂苷Rb1、Rg1、Re對(duì)K562細(xì)胞、KG1α細(xì)胞增殖影響及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制研究.pdf

1、白血病是嚴(yán)重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤,是由于造血干細(xì)胞增殖分化異常而導(dǎo)致的。迄今,白血病的治療仍主要采用大劑量聯(lián)合化療與放療,此療法副作用甚大,復(fù)發(fā)率高,尤其對(duì)機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有極大損害。在眾多的研究中,中藥以其增強(qiáng)免疫功能、功補(bǔ)兼施、毒副作用小、注意整體、應(yīng)用范圍廣泛的優(yōu)越性得到了廣泛認(rèn)可和重視。從祖國醫(yī)學(xué)寶庫中尋找出能抑制白血病細(xì)胞惡性增殖的天然中藥,已成為治療白血病的重要途徑。
　　 人參是我國傳統(tǒng)中草藥,其有

2、效化學(xué)成分為人參皂苷,人參皂苷的藥理作用廣泛,特別是在腫瘤的治療方面具有很高的藥用價(jià)值。近年來已有研究表明人參皂苷能抑制白血病細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、誘導(dǎo)分化、能增加化療藥物的敏感性和逆轉(zhuǎn)耐藥等,但具體作用機(jī)制仍不清楚。目前從人參中提取的確定的人參皂苷單體有30多種,其藥理效應(yīng)和作用機(jī)制不盡相同。其中人參皂苷Rbl、Rgl、Re是人參皂苷的主要成份。研究表明人參皂苷Rbl(gillsenoside Rbl,Rbl)具有抑制直腸癌增殖、增加化

3、療藥物的敏感性；人參皂苷Rgl(百nsenoside Rgl,Rgl)具有抗氧化、促進(jìn)記憶、增強(qiáng)免疫多種生物活性,近年來被證實(shí)可以誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡、抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖和代謝活性[6]；但抗白血病的機(jī)制還未見深入報(bào)道。而關(guān)于人參皂苷Re(ginsenoside-Re,Re)的抗腫瘤作用鮮有報(bào)道。
　　 本研究分為兩部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn):1.探討人參皂苷Rb1、Rg1、Re對(duì)KG1a白血病細(xì)胞株體外增殖的影響及其可能的作用機(jī)制；

4、2.人參皂苷Rb1、Rg1、Re對(duì)K562白血病細(xì)胞體外增殖的影響及其可能的作用機(jī)制。為發(fā)現(xiàn)與尋找調(diào)控白血病細(xì)胞增殖、或凋亡的分子靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ),為臨床治療血液學(xué)疾病提供理論基礎(chǔ)。
　　 目的:探討人參皂苷Rb1、Rg1、Re對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞株KG1α增殖的影響,并進(jìn)一步闡述可能的分子機(jī)制。
　　 方法:1.實(shí)驗(yàn)分組:陰性對(duì)照組,常規(guī)培養(yǎng)；人參皂苷Rb1組,常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上加不同濃度的Rb1(20μmol/L、40μmo

5、l/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、160μmol/L)；人參皂苷Rg1組,常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上加不同濃度的Rgl(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)；人參皂苷Re組,常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上加不同濃度的Re(30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L、150μmol/L)。分別培養(yǎng)24h、48h、72h,收集各組細(xì)胞進(jìn)行以下研究。2.MT

6、T法檢測(cè)對(duì)白血病細(xì)胞體外增殖的影響,并計(jì)算細(xì)胞抑制率。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Rb1(120μmol/L)對(duì)KG1α細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的影響。4.瑞士染色觀察Rb1作用48h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；5.Western blotting法檢測(cè)Rb1誘導(dǎo)不同時(shí)間后KG1α細(xì)胞內(nèi)p38/Phospho-p38,Erk/Phospho-Erk,JNK/Phospho-JNK和p53/Phospho-p53的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.Rb1濃度在2

7、0μmol/L-160μmol/L范圍內(nèi)對(duì)KG1a細(xì)胞增殖有抑制作用,呈濃度依賴性,于作用48h時(shí)抑制率達(dá)高峰(74.82％)。其IC50值為120μmol/L。2.Rgl濃度在5μmol/L-20μmol/L范圍內(nèi)可抑制KG1a細(xì)胞體外增殖,呈濃度依賴性,于作用48h時(shí)抑制率達(dá)高峰。抑制率最高僅為22.98％,最佳濃度為20μmol/L。3.Re對(duì)KG1a細(xì)胞增殖抑制作用不穩(wěn)定。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較Rb1組(120

8、μmol/L)G2/M期KG1α細(xì)胞比例增加,S期細(xì)胞比例下降,并能提高KG1α細(xì)胞凋亡率,于作用12h時(shí)細(xì)胞即發(fā)生明顯凋亡(5.15％),48h時(shí)細(xì)胞凋亡率最顯著(14.79％)。5.免疫印跡法顯示G-Rb1作用KG1M8h時(shí)p38總蛋白及磷酸化的p38表達(dá)顯著增加；而Erk總蛋白及其磷酸化水平上的表達(dá)均無變化；細(xì)胞內(nèi)總的JNK蛋白表達(dá)變化不明顯,而在其磷酸化水平則隨時(shí)間延長而逐漸降低。免疫印跡法顯示Rb1作用KG1a后,p53蛋白及

9、Phosho-p53蛋白表達(dá)隨時(shí)間而增加,于48h時(shí)增加最顯著。
　　 結(jié)論:人參皂苷Rg1、Rb1在一定濃度范圍內(nèi)能抑制對(duì)KG1a細(xì)胞體外增殖,以Rb1抑制作用效果最明顯,并能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。Rbl抑制KGla細(xì)胞體外增殖可能與將KG1a細(xì)胞阻滯于G2/M期有關(guān)。其可能通過影響MAPK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中p38、JNK、p53的表達(dá)與活性,從而抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2.人參皂苷Rb1、Re、Rg1對(duì)人紅白血病細(xì)胞株K56

10、2體外增殖的影響及可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　 目的:探討人參皂苷Rb1、Rg1、Re對(duì)人紅白血病細(xì)胞株K562增殖的影響,并進(jìn)一步闡述可能的分子機(jī)制。
　　 方法:1.實(shí)驗(yàn)分組:陰性對(duì)照組,常規(guī)培養(yǎng)；Rb1組,常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)加不同濃度的Rb1(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L、320μmol/L)；Rg1組,常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)加不同濃度的Rg1(51μmol/L、10μmol/L、20μmo

11、l/L、40μmol/L、80μmol/L)；Re組,常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)加不同濃度的Re(30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L、1501mol/L)。分別培養(yǎng)24h、48h、72h,收集各組細(xì)胞進(jìn)行以下研究。2.MTT法檢測(cè)對(duì)K562細(xì)胞體外增殖的影響,并計(jì)算細(xì)胞抑制率。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Rb1(160μmol/L)、Rg1(20τmol/L)作用48h對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。4.Western blotti

12、ng法檢測(cè)Rb1(160μmol/L)誘導(dǎo)不同時(shí)間后對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)p38、Erk、JNK、JAK2、STAT5及它們磷酸化水平上表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:1.Rb1濃度在20μmol/L-160μmol/L范圍內(nèi)對(duì)K562細(xì)胞增殖有抑制作用,呈濃度依賴性,于作用48h時(shí)抑制率達(dá)高峰(39.81％)。其最適濃度為160μmol/L；Rg1濃度在5μmol/L-20μmol/L范圍內(nèi)對(duì)K562細(xì)胞增殖有抑制作用,呈濃度依賴性,于作

13、用48h時(shí)抑制率達(dá)高峰(32.18％)。最佳濃度為20μmol/L。而Re對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制作用不穩(wěn)定。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示,與對(duì)照組比較Rg1組S期K562細(xì)胞比例增加,G1期細(xì)胞比例下降,而Rb1組細(xì)胞周期分布無變化。3.免疫印跡法顯示Rb1各組Erk、p38、JNK和Phospho-JNK蛋白的表達(dá)無明顯變化,而Phospho-Erk、Phospho-p38的表達(dá)隨作用時(shí)間延長而降低。4.JAK2的表達(dá)水平隨作用時(shí)間而增