人參皂苷Rg1調(diào)控FoxO3a相關(guān)信號通路抑制人臍血源基質(zhì)細胞氧化應激損傷的研究.pdf

1、造血微環(huán)境（hematopoietic inductive microenvironment,HIM）是支持和調(diào)節(jié)造血干細胞（haemopoietic stem cells,HSCs）生長發(fā)育的內(nèi)環(huán)境，其結(jié)構(gòu)和功能的完整是維系正常造血功能的重要因素?；|(zhì)細胞作為HIM的核心組分，不僅通過形成HSCs生長發(fā)育的“龕”、分泌造血因子和細胞外基質(zhì)等方式支持和調(diào)控HSCs自我更新與分化，還與多種血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關(guān)。本課題組長

2、期從事人臍血源基質(zhì)細胞（human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs）及臍血造血微環(huán)境的研究。我們的前期體外研究證實hUCBDSCs具有造血基質(zhì)細胞的基本生物學特征，能有效支持臍血CD34+細胞數(shù)量擴增；動物實驗也表明，hUCBDSCs與造血細胞聯(lián)合移植于輻照后裸鼠體內(nèi)具有促進造血重建、修復受損微環(huán)境和減輕移植物抗宿主病（GVHD,graft-versus-host

3、disease）的多重效應。
　　然而隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)hUCBDSCs存在移植后存活狀況差和植入效率較低等問題，分析主要原因可能是在體外培養(yǎng)和體內(nèi)輸注過程中會面臨營養(yǎng)缺乏、炎癥反應和氧化應激等多種不良因素刺激。這些因素導致胞內(nèi)自由基和活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量增加，細胞結(jié)構(gòu)破壞和功能失調(diào)，進而造成細胞衰老、死亡或凋亡。線粒體是細胞內(nèi)ROS的主要來源，也是最先被攻擊的細胞器。線粒體R

4、OS（mitochondrial ROS,mtROS）的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)是維系線粒體和細胞正常功能的關(guān)鍵所在。線粒體氧化應激，即mtROS的產(chǎn)生與抗氧化防御之間的不平衡，將導致線粒體功能障礙及一系列相關(guān)疾病。為確保hUCBDSCs活力和移植療效，研究如何提高細胞內(nèi)源性抗氧化保護功能和維持mtROS穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的有效途徑具有重要的理論價值和應用前景意義。
　　人參是中醫(yī)臨床“補氣要藥”，已有數(shù)千年的臨床用藥歷史。現(xiàn)代醫(yī)學研究認為，人參皂苷是人參

5、中主要的藥理學活性成分，有多達幾十種皂苷，人參皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1,G-Rg1）是其中最重要的單體皂苷成分之一。本課題組和其他學者的研究證實，人參皂苷 Rg1在抗腫瘤、抗炎癥、抗衰老、抗糖尿病、抗神經(jīng)原退化和促干/祖細胞增殖等方面有廣泛藥理學作用。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1具有拮抗氧化致衰劑對多種器官和細胞的氧化損傷與促細胞凋亡作用，提示人參皂苷Rg1是人參中重要的抗氧化皂苷。課題組既往研究證明，人參皂苷 R

6、g1不僅能促進骨髓基質(zhì)細胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）增殖分化與造血生長因子分泌，還能通過增強其在D-半乳糖誘導的應激條件下的抗氧化和抗炎能力以延緩細胞衰老。然而，人參皂苷Rg1是否對于氧化應激誘導的hUCBDSCs損傷與凋亡發(fā)揮一定的保護作用以及可能的分子機制尚未見相關(guān)報道。
　　目的：在本研究中，我們體外分離、培養(yǎng)和擴增hUCBDSCs，并采用叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydr

7、operoxide,t-BHP）損傷hUCBDSCs構(gòu)建氧化應激損傷細胞模型，研究人參皂苷Rg1拮抗hUCBDSCs氧化損傷、促進細胞存活、抑制凋亡以及維持線粒體ROS穩(wěn)態(tài)的重要作用，深入探索轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子叉頭框蛋白O3a（Fokhead box O3a,FoxO3a）介導的相關(guān)信號通路在人參皂苷Rg1發(fā)揮這些效應中的作用。旨在為闡釋人參皂苷Rg1抗氧化效應的現(xiàn)代分子生物學機制提供新的理論依據(jù)；為提高hUCBDSCs臨床移植治療效果提供新

8、的輔助手段。
　　方法：
　　1．體外分離、培養(yǎng)和擴增hUCBDSCs，采用t-BHP處理細胞構(gòu)建氧化應激損傷體外模型。分別以不同濃度人參皂苷Rg1處理損傷后的hUCBDSCs，CCK-8法檢測人參皂苷Rg1對hUCBDSCs細胞活力、細胞增殖的影響，在倒置相差顯微鏡下觀察成纖維細胞集落形成單位（colony-forming unit of fibroblast,CFU-F）的形成。以試劑盒分別檢測氧化應激相關(guān)指標，包括丙二

9、醛（malondialdehyde,MDA）含量，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的活力。
　　2．采用不同濃度人參皂苷Rg1分別處理t-BHP誘導的hUCBDSCs，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，闡明人參皂苷Rg1對細胞凋亡的影響。Western blot法檢測人參皂苷Rg1對t-BHP誘導的hUCBDSCs凋亡相關(guān)蛋白（Caspas

10、e-3、Bim、Bax和Bcl-2）表達水平的影響。Western blot法檢測Akt-FoxO3a信號通路在人參皂苷Rg1下調(diào)Bim蛋白表達水平中的作用，Western blot法檢測人參皂苷Rg1對FoxO3a在hUCBDSCs中胞核/質(zhì)轉(zhuǎn)位的調(diào)節(jié)作用。
　　3．采用不同濃度人參皂苷Rg1處理t-BHP誘導的hUCBDSCs，激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope, LSC

11、M）分別檢測人參皂苷Rg1對總ROS和mtROS生成的影響，利用LSCM檢測人參皂苷 Rg1對 t-BHP誘導的 hUCBDSCs線粒體膜電位（MMP, mitochondrial membrane potential）的影響。以試劑盒檢測人參皂苷Rg1對錳超氧化物岐化酶（Mn-SOD）和過氧化氫酶（Catalase）活力的影響。采用CCK-8法、LSCM和相應試劑盒檢測等方法明確Sirt1在人參皂苷Rg1阻抑線粒體氧化損傷中的作用，W

12、estern blot法檢測AMPK-Sirt1信號通路在人參皂苷Rg1上調(diào)FoxO3a去乙?；街械淖饔?。
　　結(jié)果：
　　1．成功構(gòu)建t-BHP誘導hUCBDSCs的氧化應激損傷體外模型
　　研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度t-BHP損傷hUCBDSCs后，細胞存活率隨t-BHP濃度的增加而逐漸降低。在t-BHP濃度（80μM）處理細胞6h時，細胞存活率降至（52±3.10）%，即IC50約為80μM。根據(jù)上述實驗結(jié)果，以80

13、μM劑量t-BHP處理細胞6h的方法構(gòu)建t-BHP誘導hUCBDSCs的氧化應激損傷體外模型。
　　2．人參皂苷Rg1抑制t-BHP誘導的hUCBDSCs損傷和凋亡
　?。?）在本研究涉及的濃度范圍內(nèi)，人參皂苷Rg1能濃度依賴的抑制t-BHP誘導hUCBDSCs的活力下降，當人參皂苷Rg1濃度為0.1、1、10和50μM時作用最為顯著。人參皂苷Rg1（50μM）還對t-BHP誘導的細胞增殖下降和CFU-F形成減少具有明顯的恢

14、復作用，且對于正常hUCBDSCs也具有一定促增殖作用。
　　（2）t-BHP損傷hUCBDSCs后MDA含量和LDH酶活性顯著上升，而SOD酶活性明顯降低。不同濃度（1、10和50μM）人參皂苷Rg1處理均能顯著降低MDA和LDH水平；當濃度為10μM和50μM時人參皂苷Rg1還能明顯提高SOD的酶活性。
　?。?）t-BHP損傷hUCBDSCs后凋亡率較正常組顯著增加，而不同濃度（1、10和50μM）人參皂苷Rg1處理均

15、能夠有效抑制t-BHP誘導的hUCBDSCs凋亡。人參皂苷Rg1（50μM）還能顯著抑制促凋亡蛋白酶Caspase-3的活化、降低促凋亡蛋白Bim和Bax的表達及提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表達。
　　3．Akt-FoxO3a-Bim信號通路在人參皂苷Rg1抑制凋亡中的作用
　　人參皂苷Rg1（50μM）能激活Akt和FoxO3a磷酸化，促進FoxO3a由胞核向胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，這一改變抑制了FoxO3a對下游凋亡誘導基因Bim的表達

16、調(diào)控，進而下調(diào)了促凋亡蛋白Bim和Bax的表達，并上調(diào)了抑凋亡蛋白Bcl-2的表達。而人參皂苷Rg1作用能被PI3K抑制劑LY29004所抑制，提示Akt-FoxO3-Bim信號通路在人參皂苷Rg1阻抑t-BHP誘導hUCBDSCs的凋亡中發(fā)揮重要作用。
　　4．人參皂苷Rg1減輕t-BHP誘導的線粒體氧化損傷
　?。?）激光掃描共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，t-BHP損傷hUCBDSCs后DCFH-DA熒光強度較正常對照組明顯升高

17、，提示胞內(nèi)總ROS水平上升。不同濃度（1、10和50μM）人參皂苷Rg1處理細胞后總ROS水平隨著人參皂苷Rg1濃度增加而逐漸下降，表明人參皂苷Rg1能抑制t-BHP誘導的胞內(nèi)活性氧水平提升。
　?。?）激光掃描共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，t-BHP損傷hUCBDSCs后MitoSOX Red紅色熒光變強，線粒體O2·-水平明顯升高。人參皂苷Rg1濃度依賴的抑制t-BHP誘導的線粒體O2·-增加，當其濃度為10μM和50μM時，O2·-

18、水平顯著低于t-BHP單處理組，提示人參皂苷Rg1具有降低線粒體活性氧水平的作用。
　　（3）激光掃描共聚焦顯微鏡觀察JC-1探針標記的hUCBDSCs，并采用紅/綠色熒光強度的比值代表線粒體膜電位（Δψm）。結(jié)果表明，與正常對照組比較，t-BHP處理細胞后Δψm明顯降低。不同濃度（1、10和50μM）人參皂苷Rg1處理細胞后Δψm隨人參皂苷Rg1濃度增加而逐漸增加，提示人參皂苷Rg1能抑制t-BHP誘導的hUCBDSCs線粒體膜

19、電位丟失。
　?。?）t-BHP損傷hUCBDSCs后導致Mn-SOD和Catalase的酶活力下降，而人參皂苷Rg1處理能濃度依賴的提高這兩種線粒體抗氧化酶的活力。當人參皂苷Rg1濃度為10μM和50μM時，Mn-SOD酶活力水平顯著高于t-BHP單處理組；人參皂苷Rg1濃度為1、10和50μM時，Catalase酶活力較t-BHP單處理組有顯著提高。結(jié)果提示人參皂苷Rg1可通過提高Mn-SOD和Catalase酶活力發(fā)揮線粒體

20、抗氧化作用。
　　5．AMPK-Sirt1-FoxO3a信號通路在人參皂苷Rg1調(diào)控線粒體活性氧水平中的作用
　?。?）人參皂苷Rg1（50μM）能顯著提高t-BHP誘導的hUCBDSCs細胞Sirt1的表達水平，且對于正常細胞Sirt1的表達也有促進作用。使用Sirt1的siRNA干擾后，人參皂苷Rg1對線粒體O2·-生成的抑制作用被明顯減弱，Mn-SOD和Catalase酶活性降低，細胞活力也隨之下降，提示Sirt1活化

21、對于人參皂苷Rg1發(fā)揮線粒體抗氧化作用是必要的。（2）t-BHP損傷hUCBDSCs后磷酸化的AMPK、Sirt1表達及去乙?；?FoxO3a表達水平均明顯降低。與 t-BHP處理組比較，人參皂苷Rg1（50μM）能顯著促進AMPK磷酸化激活和上調(diào)Sirt1表達水平，進而提高FoxO3a去乙酰化水平。分別利用AMPK siRNA和Sirt1 siRNA干擾處理后，人參皂苷Rg1這一系列效應被抑制，表明人參皂苷Rg1能夠通過激活AMPK

22、-Sirt1信號通路促進FoxO3a去乙?；M而上調(diào)FoxO3a介導的Mn-SOD和Catalase兩種酶的表達,發(fā)揮線粒體活性氧清除作用。
　　結(jié)論：
　　1．人參皂甙Rg1能夠促進t-BHP誘導hUCBDSCs的存活、提高增殖能力，并通過調(diào)控Akt-FoxO3a-Bim信號通路在抑制細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。
　　2．人參皂苷Rg1通過清除過多mtROS來保護hUCBDSCs免受t-BHP誘導的線粒體氧化損傷，