活性氮介導的內(nèi)皮細胞株損傷及人參皂苷Rg1對Aβ肽源性活性氮損傷保護機制研究.pdf

1、本文分兩部分，第一部分外源性活性氮供體GSNO對內(nèi)皮細胞損傷及機制研究
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的病變過程中可伴有活性氮(reactivenitrogen species，RNS)大量生成，但RNS對內(nèi)皮細胞的損傷機制至今仍未闡明。本研究選擇外源性RNS供體S-亞硝酰谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione，GSNO)直接作用于內(nèi)皮細胞的模型，試圖揭示RNS和內(nèi)皮細胞損傷之間內(nèi)

2、在的病理生理關聯(lián)性。研究采用在培養(yǎng)的EA.hy926內(nèi)皮細胞株(下簡稱內(nèi)皮細胞)體系中加入GSNO(0.5 mM)，通過DAPI染色和PI流式細胞術檢測到內(nèi)皮細胞呈濃度和時間依賴性凋亡。結果顯示，細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加的同時伴隨線粒體膜電位(△ψm)降低。尤為重要的發(fā)現(xiàn)是該損傷過程中，過氧亞硝酸陰離子形成和線粒體促凋亡蛋白絲氨酸蛋白酶(Omi/HtrA2)和細胞色素C(Cytochro

3、me C.CytC)從線粒體釋放至胞漿中，啟動了凋亡終端蛋白caspase3的活化，而在這一過程中未檢測到死亡受體途徑相關蛋白變化，表明GSNO可通過ROS-線粒體信號途徑誘導細胞凋亡。在該體系中加入NADPH氧化酶抑制劑apocynin，ROS清除劑TEMPOL和Omi/HtrA2抑制劑ucf-101，均能顯著抑制caspase3的活化發(fā)揮抗GSNO誘導凋亡的作用。上述結果進一步證實了外源性GSNO可引起內(nèi)皮細胞線粒體依賴性損傷，該過

4、程中ROS過表達及線粒體促凋亡蛋白Onu/HtrA2移位，在RNS誘導的內(nèi)皮細胞凋亡中起著至關重要的作用，藥物調(diào)控這些相關途徑有望發(fā)揮顯著的抗內(nèi)皮細胞損傷效應。
　　 第二部分 Aβ肽源性RNS致內(nèi)皮細胞損傷及人參皂苷Rgl保護機制研究
　　 β淀粉樣(beta-amyloid，Aβ)肽在腦實質(zhì)和腦微血管上沉積是AD的主要病理特征，但Aβ肽介導的神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞損傷機制仍不清楚。鑒于本文第一部分研究結果表明，GNSO具有

5、致內(nèi)皮細胞凋亡作用。本部分研究首先探討Aβ2s-3s肽損傷內(nèi)皮細胞模型是否有RNS產(chǎn)生及其損傷特征。并在此基礎上，評價了人參皂苷Rgl的保護機制。選擇25μM的Aβ肽作用于內(nèi)皮細胞，引起細胞存活率減少，乳酸脫氫酶釋放和顯著的細胞凋亡特征，同時伴隨細胞內(nèi)NO過表達和氧化亞硝基陰離子(Peroxynitrite anion，ONOO-)大量生成，和蛋白酪氨酸硝基化。而加入人參皂苷Rgl預處理可顯著減輕Ap肽所引起的上述細胞毒性，顯著減少Aβ

6、肽誘導的NO過表達和蛋白酪氨酸硝基化。并可部分逆轉(zhuǎn)Ap肽導致的線粒體△ψm降低，Bcl-2/Bax下調(diào)，Cyt C釋放及caspase3激活，提示人參皂苷Rgl預處理具有抗Ap肽導致的內(nèi)皮細胞線粒體依賴性凋亡作用。此外，Ap肽尚能在激活p38-MAPK的同時抑制ERK的磷酸化，并激活NF-KB核轉(zhuǎn)錄及I-KB的磷酸化，這些效應均能不同程度地被人參皂苷Rgl逆轉(zhuǎn)。另鑒于人參皂苷Rgl的核心結構與甾體類似，為論證保護作用機制是否涉及相關受體

7、，本研究尚通過甾體激素受體拮抗劑和ERK抑制劑對抗，結果表明兩者均能部分減弱Rgl的保護效應。上述試驗結果提示，Aβ肽致內(nèi)皮細胞損傷與RNS所致的蛋白硝基化和凋亡有關，糖皮質(zhì)激素受體激活和ERK減少可能涉及人參皂苷Rgl的上述抗凋亡作用，同時通過其抗氧化效應，阻斷下游級聯(lián)反應而發(fā)揮保護作用。
　　 總結：
　　 1.體外實驗體系中過量活性氮供體GSNO作用于內(nèi)皮細胞，可引起ROS的過量生成伴隨NO/過氧化亞硝基陰離子信號