人參皂苷Rg3對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠的保護作用與機制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 人參皂苷體外抗炎抗氧化作用的研究
　　目的:
　　通過體外實驗檢測人參皂苷Rh2（GRh2）、人參皂苷Rg1(GRg1)及人參皂苷Rg3(GRg3)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的外周血單個核細胞(PBMC)形成腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β(IL-1β)及一氧化氮(NO)的表達變化，了解三種人參皂苷的抗炎、抗氧化作用并進行對比，篩選出抗炎抗氧化綜合效果作用最強的人參

2、皂苷單體，為后續(xù)實驗提供理論依據(jù)。
　　材料和方法:
　　采集健康志愿者靜脈血，取PBMC進行分離培養(yǎng)，向96孔板中分別加入3μM的人參皂苷Rh2、Rg1及Rg3進行預(yù)處理，培養(yǎng)1h后加入100ng/ml的LPS，誘導(dǎo)PBMC出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，24h后吸取細胞上清液，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組中TNF-α、IL-1β及NO的濃度。
　　結(jié)果:
　　LPS處理PBMC后，上清液中TNF-α、IL-1β及

3、NO的濃度較對照組均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。人參皂苷Rh2、Rg1及Rg3預(yù)處理均可降低上清液中TNF-α、IL-1β及NO的表達(P＜0.05)，對上清液中TNF-α的表達，下降趨勢為GRg3＞GRg1＞GRh2;對于上清液中IL-1β的表達，下降趨勢為GRg3＞ GRh2及 GRg1;而對于上清液中NO的表達，下降趨勢為GRg3及GRh2＞GRg1。
　　結(jié)論:
　　人參皂苷Rh2、Rg1及Rg3預(yù)

4、處理均可降低LPS誘導(dǎo)的PBMC中TNF-α、IL-1β及NO的濃度，但人參皂苷Rg3在體外抗炎抗氧化的綜合作用強于人參皂苷Rh2、gg1。
　　第二部分 脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷自我消退模型的建立及環(huán)氧合酶2表達的研究
　　目的:
　　研究氣管內(nèi)灌注LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷(ALI)的疾病特點及轉(zhuǎn)歸過程，了解環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)在ALI中的表達變化，為后續(xù)實驗提供理論依據(jù)。

5、>　　材料和方法:
　　雄性SPF級BALB/c小鼠78只，6～8周，體重16～20g，將動物隨機分為以下3組:零點組，對照組和急性肺損傷組。以氣管內(nèi)滴注10μg/S0μl脂多糖建立小鼠ALI模型，對照組小鼠氣管內(nèi)滴注等體積生理鹽水。零點組在實驗開始時立即處死。對照組及ALI組小鼠在給藥刺激6h、12h、1d、2d、4d、7d后分別隨機處死。評估各組小鼠肺組織病理情況、濕干重比值及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MP

6、O)評分。收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid，BALF)進行細胞計數(shù)，ELISA檢測BALF中TNF-α、IL-1β的表達變化。RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)檢測小鼠肺組織COX-2mRNA的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1. 各時間點對照組小鼠肺組織的病理學(xué)無明顯變化，ALI組小鼠出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞、間隔增

7、厚，肺泡腔內(nèi)炎癥細胞浸潤，這些現(xiàn)象在12h最明顯，之后逐漸減輕;急性肺組織評分在12h達峰值，之后逐漸下降，至7d肺組織基本恢復(fù)正常。
　　2. 各時間點ALI組小鼠肺組織濕/干重比值均較對照組明顯升高，其比值在LPS刺激12h達高峰，隨后逐漸下降。
　　3. ALI組MPO活性自LPS誘導(dǎo)6h到1d呈上升趨勢，之后呈下降趨勢。
　　4. ALI組小鼠BALF中總細胞數(shù)目在1d時達峰值，隨后下降。
　　5. 急性

8、肺損傷組BALF中TNF-α及IL-1β在1d達最高值，之后逐漸下降。
　　6. ALI組小鼠肺組織COX-2 mRNA的表達自6h到12h呈上升趨勢，自12h至7d呈下降趨勢。
　　結(jié)論:
　　氣管內(nèi)滴注LPS可以成功誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷模型，ALI組小鼠病理學(xué)變化、濕/干重比值及COX-2 mRNA在LPS誘導(dǎo)12h達最高值，肺組織MPO評分、BALF中總細胞數(shù)目、TNF-α及IL-1β水平在1d達峰值，之后逐漸下降

9、，在無干預(yù)因素時，LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型可實現(xiàn)自我消退，在LPS刺激第7天基本恢復(fù)正常。
　　第三部分 人參皂苷Rg3對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠的保護作用與機制的研究
　　目的:
　　以氣管內(nèi)滴注LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型，并用不同劑量的人參皂苷Rg3(GRg3)進行干預(yù)，觀察GRg3對急性肺損傷的保護作用，并分析其對炎癥及氧化應(yīng)激中相關(guān)基因和蛋白的表達，進一步了解GRg3在急性肺損傷中發(fā)揮保護作用的機制。
　

10、　材料和方法:
　　雄性SPF級BALB/c小鼠72只隨機分為以下6組:對照組、GRg3(30mg/Kg)組、LPS組、LPS+ GRg3(10mg/Kg)組、LPS+GRg3(20mg/Kg)組、LPS+GRg3(30mg/Kg)組。GRg3以尾靜脈注射的方式進行給藥，連續(xù)2天，第2次注射后以氣管內(nèi)滴注LPS建立小鼠ALI模型。
　　評估各組小鼠肺組織病理情況、濕干重比值及MPO評分。收集BALF進行細胞計數(shù)，ELISA檢

11、測小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的表達變化。Western-Blot檢測小鼠肺組織NF-κB p65、iNOS、COX-2蛋白表達水平。RealTime-PCR檢測肺組織iNOS、COX-2 mRNA的表達情況。評估肺組織NF-κB p65DNA結(jié)合力的情況。
　　結(jié)果:
　　1. LPS組小鼠肺組織病理學(xué)損傷程度、濕/干重比值及MPO評分較對照組及GRg3組明顯升高(P＜0.05)。不同劑量的GRg3

12、預(yù)處理均可減輕ALI小鼠肺組織的病理損傷程度，降低肺組織濕/干重比值及MPO評分(P＜0.05)，且呈劑量依賴性。
　　2. 與對照組及GRg3組相比，LPS組小鼠BALF中總細胞、中性粒細胞及巨噬細胞數(shù)目均明顯增加(P＜0.05)。不同劑量的GRg3組較LPS組小鼠BALF中總細胞、中性粒細胞及巨噬細胞數(shù)目均明顯降低，并呈劑量依賴性(P＜0.05)。
　　3. LPS造模后，小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6及

13、NO表達較對照組及GRg3組明顯升高(P＜0.05)。而應(yīng)用不同劑量的GRg3預(yù)處理可降低BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的表達，并呈劑量依賴性(P＜0.05)。
　　4. 與對照組及GRg3組相比，LPS組小鼠肺組織phospho-NF-κB p65/total NF-κBp65蛋白表達比值、NF-κB p65 DNA結(jié)合能力、iNOS、COX-2的蛋白及mRNA水平均明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)

14、。應(yīng)用不同劑量的GRg3預(yù)處理后，小鼠肺組織phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65蛋白表達比值、NF-κBp65 DNA結(jié)合能力、iNOS和COX-2的蛋白及mRNA表達水平均明顯下降，并表現(xiàn)為劑量依賴性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1. 在急性肺損傷中，LPS可能通過引起小鼠肺組織NF-κB p65的磷酸化、COX-2及iNOS的表達增加誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，從而誘發(fā)急性肺損傷的形成。<