基于ARHGAP9基因的人參皂苷Rg3抗肝癌作用機制研究.pdf

1、高侵襲轉(zhuǎn)移是原發(fā)性肝癌（簡稱“肝癌”）重要的生物學特性，也是導致肝癌高死亡率的重要原因。然而，其發(fā)病機制并不明確，阻礙了肝癌的有效診治。近幾年研究表明，RhoGAP蛋白家族的許多成員，如p190RhoGAP、DLC1和ARHGAP在人肝癌組織中明顯上調(diào)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，ARHGAP9基因在肝癌組織中明顯低表達，且低表達患者相對于高表達患者預后差。ARHGAP9的高表達還抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相關信號通路的激活。由此我們推測，ARHGAP

2、9基因與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。
　　人參皂苷Rg3是人參的重要組成部分，對多種惡性腫瘤均具有抑制作用。由于其顯著的抗癌療效，人參皂苷Rg3的單體已被開發(fā)成我國一類抗癌新藥—參一膠囊。實驗和臨床研究均已證實，人參皂苷Rg3在治療肝癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。然而，人參皂苷Rg3抗肝癌的作用機制研究并不深入，缺乏臨床治療依據(jù)，限制了人參皂苷Rg3在臨床上的廣泛應用。鑒于我們前期發(fā)現(xiàn)，ARHGAP9與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關，人參皂苷Rg3

3、抗肝癌是否與ARHGAP9基因相關值得深入探討。
　　因此本課題的研究主要分為兩個部分:(1)分析ARHGAP9基因在肝癌生長及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用;(2)確定人參皂苷Rg3是否通過ARHGAP9基因抑制肝癌細胞的侵襲遷移。
　?。ㄒ唬〢RHGAP9在肝癌生長轉(zhuǎn)移中的作用研究
　　我們首先通過細胞轉(zhuǎn)染和慢病毒感染構(gòu)建了ARHGAP9基因干擾的肝癌細胞株和過表達的肝癌細胞株。然后采用CCK-8、流式細胞術、Transwell

4、等一系列實驗檢測分析ARHGAP9基因干擾和過表達對肝癌細胞增殖、周期、凋亡、侵襲和遷移能力的影響。體內(nèi)實驗，通過腋下注射ARHGAP9過表達的HepG2肝癌細胞株建立裸鼠皮下成瘤模型，分析ARHGAP9對裸鼠皮下瘤生長情況的影響。取得的實驗結(jié)果如下:
　　1、ARHGAP9在肝癌細胞系中的表達
　　6種肝癌細胞株中，ARHGAP9基因表達最高的是MHCC-97L細胞，其余5種細胞株中ARHGAP9基因的表達相對較低且相互之

5、間無顯著性差異。因此選擇MHCC-97L細胞進行基因干擾研究，選擇HepG2和MHCC-97H細胞進行基因過表達研究。
　　2、干擾ARHGAP9基因?qū)Ω伟┘毎鲋?、周期和凋亡的影?br>　　干擾ARHGAP9基因顯著促進了MHCC-97L細胞增殖，抑制細胞凋亡，且S期細胞比率增加。
　　3、過表達ARHGAP9基因?qū)Ω伟┘毎鲋?、周期和凋亡的影?br>　　過表達ARHGAP9基因顯著抑制了HepG2和MHCC-97H細

6、胞增殖，促進了細胞凋亡，并將細胞周期阻滯在G0/G1期。
　　4、ARHGAP9對肝癌細胞侵襲和遷移的影響
　　干擾ARHGAP9基因顯著促進了MHCC-97L細胞的遷移和侵襲，過表達ARHGAP9基因顯著抑制了HepG2和MHCC-97H細胞的遷移和侵襲。
　　5、ARHGAP9對裸鼠肝癌生長的影響
　　ARHGAP9過表達組腫瘤生長速度明顯低于對照組。從第24天開始，ARHGAP9過表達組腫瘤體積較對照組明顯

7、降低(p＜0.05)。
　　結(jié)論:我們的研究結(jié)果顯示，ARHGAP9基因高表達顯著抑制肝癌發(fā)展過程。
　?。ǘ┗贏RHGAP9的人參皂苷Rg3對肝癌細胞侵襲遷移的影響
　　我們采用CCK-8、Transwell、PCR、Western blot以及基因干擾等實驗觀察不同濃度20(R)-Rg3對肝癌細胞侵襲遷移能力以及對細胞內(nèi)ARHGAP9表達的影響。取得的實驗結(jié)果如下:
　　1、人參皂苷Rg3對肝癌細胞活力的

8、影響
　　采用CCK-8實驗檢測不同濃度人參皂苷Rg3對肝癌細胞活力的影響。當Rg3處理HepG2和MHCC-97L細胞24 h后，實驗組（1.25、2.5和5μg/mL）的細胞活力與對照組相比無統(tǒng)計學差異。
　　2、人參皂苷Rg3抑制肝癌細胞的侵襲遷移
　　人參皂苷Rg3在濃度為1.25、2.5和5μg/mL時均顯著抑制了HepG2和MHCC-97L細胞的侵襲和遷移。
　　3、人參皂苷Rg3提高肝癌細胞中ARH

9、GAP9的表達
　　與對照組相比，人參皂苷Rg3（2.5和5μg/mL）顯著提高了HepG2和MHCC-97L細胞中ARHGAP9蛋白的表達。
　　4、人參皂苷Rg3通過ARHGAP9抑制肝癌細胞侵襲遷移
　　沉默ARHGAP9基因后顯著緩解了人參皂苷Rg3（2.5和5μg/mL）對HepG2和MHCC-97L細胞的抗侵襲遷移作用。
　　結(jié)論:我們的研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg3可抑制肝癌細胞的侵襲遷移，且此過程與