TLR4基因編碼區(qū)非同義SNPs對(duì)LPS刺激反應(yīng)及MFHAS1調(diào)控TLR4信號(hào)通路的研究.pdf

1、膿毒癥是指機(jī)體感染微生物后發(fā)生的全身炎性反應(yīng)綜合征，是ICU危重病人死亡重要原因之一。Toll樣受體4(Toll like receptor4，TLR4)相關(guān)信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起了舉足輕重的作用，因此其功能上的缺陷可能?chē)?yán)重影響機(jī)體抵抗炎癥的免疫反應(yīng)。TLR4通過(guò)病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)識(shí)別病原體微生物，激活并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)天然免疫的產(chǎn)生，是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機(jī)制?；谀壳把芯窟M(jìn)展，本課題重點(diǎn)開(kāi)展了兩方面

2、的系統(tǒng)研究：1。利用生物信息學(xué)和基因克隆技術(shù)，探討了TLR4基因編碼區(qū)發(fā)生自然突變的非同義SNPs對(duì)LPS刺激的反應(yīng)，旨在為揭示TLR4基因多態(tài)性與膿毒癥易感性的相關(guān)研究提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。2.利用分子生物學(xué)技術(shù)，探討一個(gè)新的蛋白惡性纖維性組織細(xì)胞瘤擴(kuò)增順序1(MFHAS1)在LPS/TLR4信號(hào)通路中的功能作用，旨在為膿毒癥的標(biāo)靶治療提供新的思路。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.利用生物信息學(xué)，篩選出人TLR4基

3、因編碼區(qū)發(fā)生自然突變的非同義單核苷酸位點(diǎn)(SNPs)17個(gè)，其中胞外區(qū)14個(gè)，胞內(nèi)區(qū)3個(gè)。通過(guò)PCR及點(diǎn)突變技術(shù)成功構(gòu)建pEGFP-huTLR4質(zhì)粒及相關(guān)17個(gè)自然突變質(zhì)粒。使用LPS刺激后使用雙熒光素酶法檢測(cè)下游NF-κB報(bào)告基因活性，結(jié)果顯示其中A896G，C1196T，A2081G三個(gè)SNPs位點(diǎn)的NF-κB報(bào)告基因活性明顯降低，而其他SNPs位點(diǎn)NF-κB活性無(wú)明顯差異。其后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)此三個(gè)SNP位點(diǎn)下游炎性

4、因子TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量均明顯降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了該三個(gè)SNP位點(diǎn)功能正常與否可影響TLR4信號(hào)通路的傳遞。
　　 2.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TLR4基因敲除小鼠的單核巨噬細(xì)胞中MFHAS1的表達(dá)明顯低于野生型小鼠。其后進(jìn)一步通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默野生型小鼠單核巨噬細(xì)胞中的MFHAS1 mRNA表達(dá)，使用LPS刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，TLR4信號(hào)通路中下游的pP65、pP38、pJUN、pERK均