4-1BB和CD40信號對TLR4表達調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、Toll樣受體(TLR)是固有性免疫應(yīng)答中的重要成分，不但在感染性免疫中發(fā)揮重要作用，而且參與了腫瘤的免疫應(yīng)答和免疫逃逸過程，TLR家族中受到廣泛關(guān)注的是TLR4分子。樹突狀細胞(DC)作為機體免疫應(yīng)答的始動者，在對多種疾病應(yīng)答中，尤其是在對腫瘤的免疫應(yīng)答中發(fā)揮了不可替代的作用。已有研究表明多種因素可以影響單核細胞及樹突狀細胞上TLR4的表達，但共刺激分子CD40和4-1BB對TLR4表達的影響尚未見報道。本研究旨在通過激活DC或單核細

2、胞上CD40或4-1BB分子后，觀察TLR4分子表達的變化，以期為腫瘤免疫治療提供新的方法與思路。 1．4-1BB信號對小鼠樹突狀細胞TLR4表達的調(diào)節(jié) 目的：探討激發(fā)型小鼠4．1BB(CDl37)單克隆抗體2A對小鼠骨髓來源未成熟DC(imDC)及樹突狀細胞株DC2．4表面TLR4表達的調(diào)節(jié)。方法：在imDC中加入不同劑量2A(聯(lián)合兔抗大鼠IgG-Fc段抗體，CL)、LPS、2A(+CL)與LPS聯(lián)合后作用6h，流式細

3、胞術(shù)(FCM)檢測TLR4表達；或在以上處理因素作用后不同時相(0h、3h、6h、12h、24h)，以及先用LPS刺激imDC6h再加入2A(+CL)作用6h后，以FCM檢測imDC表面TLR4表達。結(jié)果：LPS可下調(diào)imDC上TLR4的表達，作用可維持24h。單獨使用2A無明顯效應(yīng)，但與CL聯(lián)合后2A可使imDC上調(diào)TLR4分子的表達，作用可維持12h。2A(+CL)與LPS聯(lián)合作用仍可使imDC上調(diào)表達TLR4分子。先用LPS預(yù)處理

4、imDC6h再加入2A作用6h，2A仍可拮抗LPS的下調(diào)作用。在樹突狀細胞株DC2．4細胞表面也得到相似的結(jié)果。結(jié)論：4—1BB信號可上調(diào)小鼠骨髓來源未成熟DC和樹突狀細胞株DC2．4表面TLR4的表達，上調(diào)效應(yīng)具有時間和劑量依賴性，并可拮抗LPS介導(dǎo)的TLR4下調(diào)效應(yīng)。 2．CI)40信號對人單核細胞和樹突狀細胞TLR4表達的調(diào)節(jié) 目的：探討人激發(fā)型CD40單克隆抗體5C11對人單核細胞和樹突狀細胞TLR4表達的調(diào)節(jié)。

5、方法：外周血單個核細胞貼壁后可獲取單核細胞，在GM-CSF和IL-4作用下單核細胞向DC分化發(fā)育。不同刺激物(rhlL-2、rhlL-4、5C1l、羊抗小鼠IgG-Fc段抗體(CL)、5C1HCL、5C11+CL+rhlL-2、5C11+CL+rhIL-4)作用于單核細胞24h后以FCM檢測TLR4表達：5C11和／或CL作用于單核細胞后的不同時相(Oh、2h、4h、24h)，以及單核細胞向未成熟DC分化發(fā)育過程中FCM檢測TLR4的表

6、達；FCM檢測各種不同刺激物(LPS、TNF-ot、5C11、CL、5C1HCL)作用于未成熟DC24或48h后TLR4的表達，并用RT-PCR方法檢測5C11和／或CL刺激未成熟DC48h后TLR4表達水平。結(jié)果：新鮮分離的單核細胞表達高水平TLR4，培養(yǎng)24h后表達迅速下降，聯(lián)合使用5C11與CL后可以有效拮抗這一過程，使TLR4表達維持在中等水平，單獨加入rhIL-2、rhIL-4、5C1l或CL未能影響TLR4表達。單核細胞向未

7、成熟DC分化發(fā)育過程中，TLR4呈極低水平表達。LPS、TNF-α、5C11、CL或聯(lián)合使用5C¨與CE作用于未成熟DC24或48h后，僅聯(lián)合使用組可顯著促進TLR4表達，且蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平一致。結(jié)論：CD40信號可以維持人單核細胞上TLR4的表達，并促進人成熟樹突狀細胞表達TLR4分子。 本實驗中都使用了IgG-Fc段抗體作為交聯(lián)劑以提高4-1BB信號和CD40信號強度，促進單核細胞和DC表達TLR4分子。近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)表達