DOCK2對中性粒細胞凋亡和表達TLR4的影響.pdf

1、目的：中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophils，PMNs）是機體最重要的炎癥細胞，它在機體固有性免疫應(yīng)答中具有重要作用，其胞漿內(nèi)富含的細胞毒性物質(zhì)既可殺傷外來入侵的病原微生物，也可造成自身組織細胞的損傷。研究表明，中性粒細胞粘附、活化及凋亡的整個過程可受Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）的調(diào)節(jié)，促成炎癥反應(yīng)的無損傷性收斂，使機體維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。其中，TLR4是人們最早發(fā)現(xiàn)的

2、能夠直接介導(dǎo)機體與病原體反應(yīng)的Toll樣受體。最近，日本科學家發(fā)現(xiàn)一種與中性粒細胞的趨化有關(guān)的蛋白DOCK2（Dedicator of cytokinesis2）[1]，其聚集到中性粒細胞內(nèi)朝著感染源的一側(cè)，使中性粒細胞改變自身形態(tài)，更高效地向感染源移動。本課題主要探討DOCK2與中性粒細胞凋亡的相關(guān)性以及DOCK2與中性粒細胞上表達的TLR4之間的聯(lián)系。這為今后更深入研究中性粒細胞抗感染能力的機制提供了潛在的依據(jù)，也為臨床上治療炎癥性

3、相關(guān)疾病提供了新的靶點。方法：抽取健康成人外周靜脈血，F(xiàn)icoll密度梯度法分離、純化中性粒細胞，并利用臺盼藍拒染試驗、懷特-姬姆薩混合染色法鑒定細胞活力與純度均達96％以上，按實驗需求構(gòu)建不同的實驗?zāi)Ｐ停簩嶒灲M（DOCK-2刺激組）、陽性對照組（IL-1β刺激組、TNF-α刺激組）、陰性對照組（空白組）。運用光學顯微鏡觀察不同培養(yǎng)狀態(tài)下的細胞形態(tài)；用流式細胞術(shù)檢測不同組中性粒細胞的凋亡率；通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢

4、測TLR4mRNA在各組中的表達情況；免疫印跡（western blotting）技術(shù)檢測各組中TLR4的表達情況。結(jié)果：1.運用流式細胞術(shù)檢測DOCK2對PMNs凋亡是否有影響，結(jié)果顯示：與空白組比較，DOCK2組PMN凋亡率是下降的，具有明顯的差異性（P<0.05）。2.RT-PCR技術(shù)檢測PMNs在不同藥物刺激組中TLR4 mRNA的表達情況。結(jié)果顯示：同空白組相比，DOCK2組TLR4 mRNA的表達上調(diào)，且有明顯的差異性（P<

5、0.01）。3.培養(yǎng)6 h后，將各組模型組中的中性粒細胞裂解，提取總蛋白進行SDS-PAGE并相互比較。結(jié)果顯示：在不同刺激物刺激下，中性粒細胞上TLR4蛋白質(zhì)表達的性質(zhì)和數(shù)量發(fā)生了不同程度的改變。4.不同實驗組刺激PMN6 h后，提取蛋白并用Western blotting檢測TLR4蛋白的表達。結(jié)果顯示：同空白組相比，DOCK2組TLR4蛋白的表達是上調(diào)的，有明顯的差異性（P<0.01）。結(jié)論：1.DOCK2可能對PMNs的凋亡有延