TLR4促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和凋亡抵抗的分子機(jī)制研究.pdf

1、臨床與流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)慢性感染和炎癥紊亂與腫瘤發(fā)生有關(guān)，其中慢性炎癥促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一。近年來腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)與腫瘤免疫逃逸的關(guān)系倍受關(guān)注。研究證明，在慢性感染或炎癥條件下，TLR4誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生成大量的免疫抑制性因子抑制免疫細(xì)胞啟動(dòng)免疫應(yīng)答，同時(shí)局部感染細(xì)胞大量增殖并抵抗凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活。因此打破腫瘤免疫逃逸可能成為預(yù)防和治

2、療腫瘤的重要手段。雷帕霉素(Rapamycin)是一種廣泛用于治療自身免疫和移植排斥疾病的免疫抑制劑，最近幾年用于治療腫瘤、抑制血管形成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，我們提出Rapamycin這種抗炎藥物是否能夠阻斷TLR4介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，從而起到抗腫瘤的效應(yīng)。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人HT29和鼠CT26結(jié)腸癌細(xì)胞組成性地表達(dá)較高水平的TLR4，提示TLR4信號(hào)可能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞免疫逃逸。首先我們用RT-PCR方法檢測TLR4信號(hào)對(duì)免疫

3、抑制因子表達(dá)譜的影響，結(jié)果顯示，LPS刺激后，LPS上調(diào)CT26細(xì)胞中IL-6和COX-2的表達(dá)，隨后證明LPS刺激能夠促進(jìn)IL-6和PGE2的合成，這些因子不僅抑制免疫細(xì)胞功能而且能夠促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤和存活。由于IL-6和PGE2是非常重要的調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和浸潤的分子，因此，我們進(jìn)一步研究是否LPS能夠通過IL-6和PGE2自分泌促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤，以及是否Rapamycin抑制了LPS誘導(dǎo)IL-6和PGE2的產(chǎn)生，從

4、而降低CT26細(xì)胞的活力。在臨床治療時(shí)，Rapamycin可能通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞分泌IL-6和PGE2而發(fā)揮抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的抗腫瘤效應(yīng)。 Rapamycin抑制TLR4信號(hào)促進(jìn)CT26結(jié)腸癌細(xì)胞IL-6、PGE2分泌并降低LPS誘導(dǎo)的凋亡抵抗。那么，其可能的分子信號(hào)機(jī)制如何呢?首先我們利用FACS對(duì)TLR4受體膜表面的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Rapamycin能夠抑制TLR4在細(xì)胞膜上的表達(dá)，但對(duì)TLR4的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響，提示Rap

5、amycin可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)如抑制TLR4的糖基化或向胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過程而降低膜表面的表達(dá)，Rapamycin介導(dǎo)TLR4的下調(diào)可能削弱了LPS所誘導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。隨后我們對(duì)TLR4介導(dǎo)的MAPKs、Akt和NF-kB信號(hào)途徑進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CT26細(xì)胞中，Rapamycin對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAPKs激酶p38、ERK1／2、JNK1／2的活化沒有影響，但顯著抑制了Akt磷酸化及NF-KB信號(hào)途徑。提示Rapamycin可能通過抑

6、制這兩條信號(hào)通路從而抑制IL-6和PGE2的合成及凋亡抵抗逆轉(zhuǎn)。為了證實(shí)這一點(diǎn)，Akt和NF-KB信號(hào)分子特異性的抑制劑LY209400及PDTC處理阻斷信號(hào)后，ELISA檢測免疫抑制性因子的生成，結(jié)果顯示與Rapamycin~H似，LY209400及PDTC均能有效抑制IL-6和PGE2的分泌；同樣地，LY209400及PDTC均能有效逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)腫瘤藥物OXL和DXR的抵抗作用?？赏茢郣apamycin作用于Akt和NF-KB信號(hào)分

7、子抑制TLR4介導(dǎo)的CT26分泌IL-6和PGE2及OXL和DXR誘導(dǎo)的凋亡抵抗。 綜上所述，Rapamycin能夠降低結(jié)腸癌TLR4膜表面的表達(dá)和抑制Akt／IKKα／β/NF-KB級(jí)聯(lián)通路，從而抑制了TLR4介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自分泌IL-6和PGE2及其所誘導(dǎo)的腫瘤遷移和浸潤，并逆轉(zhuǎn)了TLR4所介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡抵抗。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從新的角度解釋了Rapamycin通過抑制參與免疫逃逸的因子的形成及增強(qiáng)抗腫瘤藥物敏感性從而打破免疫

8、逃逸以發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，進(jìn)一步提示了Rapamycin可用于結(jié)腸癌的治療。 高頻率重組蛋白-1(High-mobility group box-1，HMGB1)最初被鑒定為DNA體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控協(xié)同因子。免疫刺激時(shí)，炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞被活化導(dǎo)致HMGB1被包裝到溶酶體然后釋放到胞外環(huán)境；壞死或受損的體細(xì)胞以被動(dòng)的方式釋放HMGB1。一旦釋放到胞外，HMGB1發(fā)揮致炎因子作用活化內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管形成，炎癥細(xì)胞和干細(xì)胞向血管外的遷移，

9、通過活化一系列關(guān)鍵信號(hào)途徑從而啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的活化、生長及死亡。因此，HMGB1涉及到多種疾病，包括帕金森、膿血癥、缺血再灌注及自身免疫疾病。HMGB1到胞外環(huán)境且與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。最近研究表明，HMGB1與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)，而且，HMGB1是TLR4的內(nèi)源性配體，因此，我們研究了在放療和生物治療過程中由壞死細(xì)胞釋放的HMGB1是否能夠作為一個(gè)旁分泌因子促進(jìn)肝癌的發(fā)展。我們研究發(fā)現(xiàn)，在放療和TRAIL治療過程中，源于死亡的

10、肝癌細(xì)胞株SMMC-7721上清能夠誘導(dǎo)SMMC-772l細(xì)胞表達(dá)免疫抑制性細(xì)胞因子VEGF和趨化因子MIP-3α、IP-10和MCP-1。為了確定是否死亡細(xì)胞釋放的HMGB1誘導(dǎo)了這種炎癥效應(yīng)，我們干擾了SMMC-7221細(xì)胞HMGB1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB1干擾的壞死細(xì)胞的上清對(duì)MIP-3α的誘導(dǎo)能力顯著減弱，證實(shí)了死亡細(xì)胞釋放HMGB1并將信號(hào)傳遞于其周邊細(xì)胞。重組的HMGB1也能促進(jìn)高水平MIP-3α的表達(dá)，進(jìn)一步表明了上清中的H

11、MGB1促進(jìn)了免疫抑制性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。 由于HMGB1能夠介導(dǎo)神經(jīng)節(jié)瘤的生長和擴(kuò)散，所以我們研究了HMGB1和死亡細(xì)胞上清是否能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。MTT檢測發(fā)現(xiàn)，HMGB1能夠促進(jìn)SMMC-7721增殖，BrdU參入法檢測細(xì)胞增殖進(jìn)一步證實(shí)死亡細(xì)胞上清和HMGB1能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長。然后，我們研究了是否HMGB1通過加速細(xì)胞周期進(jìn)程從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期分析表明，重組HMGB1加速G1向S期的轉(zhuǎn)化，從而促

12、進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，由于放療和化療誘導(dǎo)死亡細(xì)胞可能通過釋放高水平HMGB1加速細(xì)胞周期進(jìn)程從而促進(jìn)腫瘤的生長和惡化。 如前面所述，重組HMGB1和源于死亡細(xì)胞的上清能夠促進(jìn)肝癌SMMC-7721細(xì)胞免疫抑制細(xì)胞因子VEGF和趨化因子MIP-3α，IP-10 和IMCP-1的表達(dá)。另外，HMGB1是TLR4內(nèi)源性配體，因而，為了進(jìn)一步證實(shí)HMGB1是否通過TLR4／MyD88信號(hào)途徑而介導(dǎo)免疫逃逸的誘導(dǎo)，我們構(gòu)建了

13、針對(duì)于SMMC-7721細(xì)胞TLR4和HMyD88的干擾載體。RT-PCR檢測表明，HMGB1或死亡細(xì)胞上清處理TLR4或MyD88缺陷的SMMC-7721細(xì)胞后，對(duì)MIP-3αmRNA誘導(dǎo)表達(dá)能力顯著降低，說明重組的HNGB1和死亡細(xì)胞的上清介導(dǎo)MIP-3α表達(dá)依賴于TLR4／MyD88信號(hào)途徑。 另外，與LPS刺激相似，HMGB1能夠活化SMMC-7721細(xì)胞p38MAPK、ERK1／2、JNK和NF-KB信號(hào)通路。因此，我

14、們研究了HMGB1是否通過MAPK或NF-K B參與細(xì)胞周期和凋亡抵抗的調(diào)節(jié)。Western blot檢測表明MEK1／2(PD98059)和ERK1／2(U0126)抑制劑能夠顯著抑制HMGB1誘導(dǎo)的SMMC-7721細(xì)胞p27磷酸化及其降解以及周期素D1的表達(dá)。而NF-KB抑制劑PDTC下調(diào)HMGB1所誘導(dǎo)的抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)。因此，HMGB1／TLR4誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化是由MEK1／2／ERK1／2信號(hào)通路介導(dǎo)，而N

15、F-KB是促進(jìn)HMGB1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡抵抗的關(guān)鍵信號(hào)分子。因此，HMGB1／TLR4信號(hào)介導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡抵抗和加速細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化過程，從而促進(jìn)肝癌免疫逃逸和進(jìn)一步發(fā)展。 綜上所述，由30 Gy-co-ray放療或TRAIL處理所導(dǎo)致死亡的肝癌細(xì)胞的分泌上清能夠反饋性地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)免疫抑制細(xì)胞因子VEGF和趨化因子MIP-3α、IP-10和MCP-1，死亡的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞釋放的HMGB1介導(dǎo)了此種效應(yīng)。HMGB1通過增強(qiáng)cyc

16、linD表達(dá)及p27-T187磷酸化和降解而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞G1-S期的進(jìn)程。另外，HMGB1可通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的抵抗，提示，放化療導(dǎo)致死亡的肝癌細(xì)胞釋放的HMGB1參與了腫瘤的逃避免疫和凋亡抵抗。干擾HMGB1或TLR4／MyD88之后，死亡的肝癌細(xì)胞以及重組HMGB1均不能有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)MIP-3 α，進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1／TLR4／MyD88途徑依賴的放化療促進(jìn)肝癌的免疫逃逸作