異氟醚預(yù)處理下調(diào)TLR4抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和自噬.pdf

1、腦血管疾病是因顱內(nèi)血液循環(huán)障礙而造成腦組織損害的一組疾病，臨床上以急性發(fā)病居多，分為出血性和缺血性兩類，其中缺血性疾病更占多數(shù)。局灶性腦缺血和全腦缺血都是圍術(shù)期嚴(yán)重的并發(fā)癥。局灶性腦卒中治療的重點是腦缺血半暗帶，而發(fā)生全腦缺血時最敏感的區(qū)域是海馬。腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷，在缺血部位恢復(fù)血液灌注后，其損傷進一步加重，稱之為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury）。其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及能

2、量代謝障礙，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，氧化應(yīng)激，炎癥損傷及細(xì)胞凋亡等等。這些環(huán)節(jié)相互聯(lián)系，相互激發(fā)，形成快速級聯(lián)反應(yīng)，迅速加重?fù)p傷。
　　近年來，大量研究顯示異氟醚預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷有保護作用，但是其確切機制尚不清楚。以往研究認(rèn)為異氟醚預(yù)處理抑制了腦缺血再灌注過程中的炎性反應(yīng)，而Toll樣受體4（Toll like receptors，TLR4）屬于先天性免疫細(xì)胞中的跨膜受體及病原模式識別受體，在急性炎癥反應(yīng)中調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬作用，以及

3、在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡中起重要作用。有研究表明TLR4參與了腦缺血再灌注損傷時神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，那么異氟醚預(yù)處理是否參與了該途徑而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究針對這一問題進行了進一步研究，為異氟醚預(yù)處理和腦保護研究提供新的理論和實驗依據(jù)。
　　第一部分異氟醚預(yù)處理對小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用
　　目的：明確異氟醚預(yù)處理是否影響局灶性腦缺血損傷時缺血半暗帶區(qū)域TLR4的表達(dá)。
　　方法：健康雄性C57BL/6小鼠3

4、0只，隨機分為3組（n=10）。假手術(shù)組（sham組）：只分離血管，不進行其余操作。局灶性腦缺血再灌注組（I/R組）：制備右側(cè)大腦中動脈阻塞（Middle Cerebral Arterial Occlusion，MCAO）模型，60min后拔出線栓，恢復(fù)血供24h。異氟醚預(yù)處理組（ISO組）：使用1.5％異氟醚預(yù)處理2h，24h后制作MCAO模型，60min后拔出線栓，恢復(fù)血供24h。通過Western Blot法檢測各組小鼠右側(cè)腦缺血

5、半暗帶區(qū)域TLR4和LAMP2A的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：Western Blot法檢測顯示，與sham組比較，I/R組和ISO組受到缺血再灌注損傷，缺血半暗帶TLR4蛋白和LAMP2A表達(dá)顯著增高，p＜0.05；而與 I/R組比較，ISO組接受異氟醚預(yù)處理，其缺血半暗帶 TLR4和 LAMP2A蛋白表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)意義，p＜0.05。
　　結(jié)論：異氟醚預(yù)處理降低小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷時腦缺血半暗帶區(qū)域TLR4和LAMP

6、2A蛋白的表達(dá)。
　　第二部分異氟醚預(yù)處理對小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護作用
　　目的：明確異氟醚預(yù)處理是否影響全腦缺血再灌注損傷時海馬區(qū)域和皮層神經(jīng)細(xì)胞TLR4和LAMP2A的表達(dá)。
　　方法：健康雄性 C57BL/6小鼠30只，隨機分為3組（n=10）。假手術(shù)組（sham組）：只分離血管，不進行其余操作。全腦缺血再灌注組（I/R組）：夾閉雙側(cè)頸動脈制作全腦缺血模型，10min后開放雙側(cè)頸動脈，恢復(fù)大腦血供。異氟醚預(yù)

7、處理組（ISO組）：使用1.5%異氟醚預(yù)處理2h，24h后制作全腦缺血模型，10min后開放雙側(cè)頸動脈，恢復(fù)大腦血供。24h后，通過Western Blot法檢測各組小鼠海馬區(qū)TLR4和LAMP2A蛋白表達(dá)的情況。
　　結(jié)果：Western Blot法檢測顯示，與sham組比較，I/R組和ISO組受到缺血再灌注損傷，海馬區(qū)TLR4和LAMP2A蛋白表達(dá)顯著增高，p＜0.05；而與I/R組比較，ISO組接受異氟醚預(yù)處理，其海馬區(qū)TL

8、R4和LAMP2A蛋白表達(dá)降低，有統(tǒng)計學(xué)意義，p＜0.05。
　　結(jié)論：異氟醚預(yù)處理降低小鼠全腦缺血再灌注損傷時海馬區(qū)TLR4和LAMP2A蛋白的表達(dá)。
　　第三部分異氟醚預(yù)處理對離體神經(jīng)元缺血再灌注損傷時TLR4和LAMP2A表達(dá)的影響
　　目的：明確異氟醚預(yù)處理對離體神經(jīng)元缺血再灌注損傷時TLR4和LAMP2A表達(dá)的影響。
　　方法：原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞隨機分為3組。對照組（sham組），細(xì)胞不經(jīng)任何處理；氧糖

9、剝奪組（OGD組），于神經(jīng)細(xì)胞接種第8天進行OGD處理2h，復(fù)氧復(fù)糖24h；異氟醚預(yù)處理組（ISO組），于神經(jīng)細(xì)胞接種第7天進行異氟醚預(yù)處理，24h后進行 OGD處理2h，復(fù)氧復(fù)糖24h。通過細(xì)胞免疫熒光染色和Western Blot法檢測神經(jīng)元TLR4和NF-κB的表達(dá)。
　　結(jié)果：細(xì)胞免疫組化染色顯示 OGD/R損傷可以造成神經(jīng)元 TLR4和LAMP2A表達(dá)增加，接受異氟醚預(yù)處理可以減少 OGD/R損傷后 TLR4和LAMP2

10、A的表達(dá)。Western Blot法測定各組TLR4和LAMP2A表達(dá)，也可以得到相同結(jié)果。
　　結(jié)論：異氟醚預(yù)處理降低離體神經(jīng)元缺血再灌注損傷時TLR4和LAMP2A的表達(dá)。
　　第四部分異氟醚預(yù)處理通過下調(diào)TLR4抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和自噬
　　目的：研究異氟醚預(yù)處理對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護作用及機制。方法：培養(yǎng)至對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，隨機分為5組：對照組（sham組），細(xì)胞不經(jīng)任何處理；氧糖剝奪模型組（OG

11、D組），進行OGD處理4h，復(fù)氧復(fù)糖24h；異氟醚預(yù)處理組（ISO pc+OGD，ISO組），進行異氟醚預(yù)處理后24h再進行OGD/R處理；TLR4抑制劑組（CLI-095+OGD，CLI-095組），進行OGD/R處理前24h給與TLR4抑制劑CLI-095；TLR4激動劑組（ISO pc+LPS+OGD， LPS組），細(xì)胞傳代后加入TLR4激動劑LPS，24h后進行異氟醚預(yù)處理2h，24h后再進行OGD/R處理。
　　通過 M

12、TT法檢測細(xì)胞存活數(shù)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。通過Western Blot法檢測各組細(xì)胞TLR4、NF-κB和LAMP2A的表達(dá)。
　　結(jié)果：通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)與sham組相比，OGD組、ISO組、CLI-095組和LPS組OD值顯著降低。而與OGD組相比，ISO組和CLI-095組OD值增高。LPS組OD值與OGD組沒有顯著差異。
　　通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率，與sham組相比，OGD組、ISO組、CL

13、I-095組和LPS組PC12細(xì)胞凋亡率均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而ISO組和CLI-095組的細(xì)胞凋亡率與OGD組相比較明顯下降，LPS組凋亡率與OGD組相比較無明顯差異。
　　使用Western Blot法測定各組PC12細(xì)胞的TLR4、NF-κB和LAMP2A蛋白表達(dá)，與sham組比較，OGD組、ISO組、CLI-095組和LPS組TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)顯著增高；與OGD組比較，ISO組和 CLI-095組 TLR4、

14、NF-κB和LAMP2A蛋白表達(dá)顯著降低，而LPS組的蛋白表達(dá)無明顯差異。
　　結(jié)論：異氟醚預(yù)處理通過下調(diào)TLR4抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和自噬對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護作用。
　　在腦缺血再灌注損傷發(fā)生時除了炎性反應(yīng)被激活，分子伴侶介導(dǎo)的自噬也被激活。異氟醚預(yù)處理可以抑制神經(jīng)元TLR4激活，而TLR4對CMA也具有一定的調(diào)控作用。表現(xiàn)為異氟醚預(yù)處理可以使LAMP2A的表達(dá)減少，而給與TLR4抑制劑后，LAMP2A表達(dá)相應(yīng)增加