TLR4參與腦缺血再灌注小鼠皮質(zhì)和海馬細(xì)胞凋亡.pdf

1、腦血管疾病是目前嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，其中缺血性疾病更占多數(shù)。腦缺血致腦細(xì)胞損傷，當(dāng)恢復(fù)血液灌注后，其缺血性損傷反而進(jìn)一步加重，我們稱其為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia—reperfusion injury)。其發(fā)病機(jī)制涉及能量代謝障礙，細(xì)胞酸中毒，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，氧化應(yīng)激損傷，興奮性氨基酸生成，炎癥損傷及細(xì)胞凋亡等。這些環(huán)節(jié)彼此重疊，并相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)。 凋亡，也稱程序性細(xì)胞死亡，凋亡機(jī)制在

2、缺血性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，但其確切機(jī)制尚不清楚。腦缺血損傷后，凋亡程序的激活需要新基因的表達(dá)和某些“死亡蛋白”的合成。內(nèi)源性凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)可能在決定缺血神經(jīng)細(xì)胞的生死命運(yùn)中起關(guān)鍵作用。caspase家族是一大類凋亡調(diào)節(jié)基因，其中caspase—3是caspase級(jí)聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中caspase—3不僅可促進(jìn)腦發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元的凋亡；還可促進(jìn)各種因素

3、誘導(dǎo)的培養(yǎng)神經(jīng)元的凋亡，提示caspase—3可能是缺血神經(jīng)元凋亡重要效應(yīng)分子。 Toll樣受體4(Toll like recep tors，TLR4)是與果蠅Toll蛋白同源的人Toll蛋白基因編碼的Toll樣受體蛋白，是新近發(fā)現(xiàn)的先天性免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞跨膜受體及病原模式識(shí)別受體之一，在急性炎癥反應(yīng)細(xì)胞吞噬作用的調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡中起重要作用。它主要介導(dǎo)G—菌感染LPS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致NF—κB的轉(zhuǎn)位與相應(yīng)免疫基

4、因的活化而轉(zhuǎn)錄，釋放前炎癥因子及輔助刺激分子(Co—stimulate moleculars)，起到調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在腦缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)中起到了非常重要的作用，TLR4很可能參與了腦缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡機(jī)制中的某個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路，但它如何具體參與哪項(xiàng)機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。 本文利用免疫組織化學(xué)、TUNEL法及Western blot方法，觀察在缺血再灌注后及缺血再灌注后阻斷TLR4，小鼠大腦皮

5、質(zhì)和海馬兩個(gè)部位的Caspase—3表達(dá)量的變化和細(xì)胞凋亡情況，探討TLR4與小鼠腦缺血再關(guān)注損傷中細(xì)胞凋亡的關(guān)系。通過(guò)這些問(wèn)題的解決，我們將進(jìn)一步清楚腦缺血再灌注損傷發(fā)病的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為尋找新的治療方法提供理論依據(jù)。 材料和方法: 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究采用中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康昆明小鼠90只，體重20-30g。 2、主要試劑TLR4單克隆抗體(Santa Cruz公司)，Cas

6、pase—3兔抗鼠多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，二抗山羊抗兔多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，TUNEL檢測(cè)試劑盒(Roche公司)，免疫組化SP試劑盒和DAB試劑盒(邁新公司)。β—actin，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二次抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔二次抗體均購(gòu)于北京中山公司。 3、主要儀器電熱恒溫干燥箱；電子分析天平；恒溫水浴箱；低溫冷凍離心機(jī)；紫外分光光度計(jì)；通用電泳儀；轉(zhuǎn)印儀；正置熒光顯微鏡；

7、—80度深低溫冰箱；恒溫冰凍切片機(jī)；Motic Images Advanced3.2圖象分析系統(tǒng)；勻漿機(jī)；離心機(jī)：加樣器。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、制備腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型．采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈法。 2、動(dòng)物處理和分組動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組30只：假手術(shù)組(Sham)；缺血再灌注組(I/R)；TLR4抗體阻斷組(TLR4)。I/R組和TLR4組采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成短暫前腦缺血12 min，TLR4阻斷組在缺血后

8、從右側(cè)頸總動(dòng)脈由微量注射器注入TLR4抗體(10mg/ml)。Sham組只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈12 min，之后再分為再灌注6h、12h、24h、48h、72h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)。 3、HE染色觀察皮質(zhì)、海馬組織病理學(xué)變化。 4、免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中Caspase—3的表達(dá)。 5、Western blot方法檢測(cè)各組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中Caspase—3的表達(dá)。 6、TUNEL法原位檢測(cè)各

9、組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中的細(xì)胞凋亡情況。 7、圖象分析 HE染色切片圖像分析，并進(jìn)行神經(jīng)病理?yè)p傷評(píng)分。Western blot結(jié)果用ChemiImager5500V2.03軟件掃描，用Fluor Chen2.0軟件定量分析顯色帶的IDV值。免疫組化結(jié)果用Motic Images Advanced3.2實(shí)時(shí)圖象分析系統(tǒng)采集照片并進(jìn)行定量分析。TUNEL法原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果在高倍顯微鏡下測(cè)定海馬區(qū)5視野凋亡細(xì)胞的平均凋亡

10、率。 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較進(jìn)行單因素方差分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、組織病理學(xué)觀察結(jié)果及神經(jīng)病理?yè)p傷評(píng)分結(jié)果 HE染色可見(jiàn)假手術(shù)組皮質(zhì)和海馬細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞排列整齊、形態(tài)完整；缺血再灌注組細(xì)胞排列散亂，有的胞漿空泡形成，有的神經(jīng)元腫脹、分布不均、核固縮深染、核仁消失；TLR4阻斷組神經(jīng)元胞體腫脹明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)明顯改

11、善。 假手術(shù)組皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元在各再灌注時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)病理?yè)p傷評(píng)分均較低；TLR4阻斷組和缺血再灌注組的神經(jīng)病理?yè)p傷評(píng)分均有不同程度的增高，兩組與假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.05)。TLR4阻斷組在各再灌注時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)病理?yè)p傷評(píng)分均低于缺血再灌注組(P<0.05)。 2、Caspase—3在皮質(zhì)的表達(dá)和TUNEL皮質(zhì)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：在相同時(shí)間點(diǎn)，缺血再灌注組大腦皮質(zhì)部Caspase—3陽(yáng)性

12、產(chǎn)物的平均光密度值(MOD)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；而TLR4阻斷組與缺血再灌注組相比，大腦皮質(zhì)部Caspase—3陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值明顯降低(P<0.05)。 Western blot結(jié)果顯示：在相同時(shí)間點(diǎn)，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組小鼠大腦皮質(zhì)部Caspase—3目標(biāo)帶的IDV(integrated density value)與內(nèi)參照IDV的比值均明顯升高(P<0.05)，而TLR4阻斷組上述部位樣品中

13、Caspase—3目標(biāo)帶的IDV與內(nèi)參照IDV的比值均明顯低于缺血再灌注組(P<0.05)。 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：在相同時(shí)間點(diǎn)，缺血再灌注組大腦皮質(zhì)部凋亡細(xì)胞較假手術(shù)組高，TLR4阻斷組大腦皮質(zhì)部凋亡細(xì)胞較缺血再灌注組減少(p<0.05)。 3、Caspase—3在海馬的表達(dá)和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：在相同時(shí)間點(diǎn)，缺血再灌注組大腦海馬部Caspase—3陽(yáng)性產(chǎn)物的平均光密度值

14、(MOD)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；而TLR4阻斷組與缺血再灌注組相比，大腦海馬部Caspase—3陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值明顯降低(P<0.05)。 Western blot結(jié)果顯示：在相同時(shí)間點(diǎn)，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組小鼠大腦海馬部Caspase—3目標(biāo)帶的IDV(integrated density value)與內(nèi)參照IDV的比值均明顯升高(P<0.05)，而TLR4阻斷組上述部位樣品中Caspase—3

15、目標(biāo)帶的IDV與內(nèi)參照IDV的比值均明顯低于缺血再灌注組(P＜0.05)。 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：在相同時(shí)間點(diǎn)，缺血再灌注組大腦海馬部凋亡細(xì)胞較假手術(shù)組高，TLR4阻斷組大腦海馬部凋亡細(xì)胞較缺血再灌注組減少(p<0.05)。 結(jié)論: 缺血再灌注組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬部位Caspase—3表達(dá)量和神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增多，TLR4阻斷后，明顯減少，提示TLR4參與了小鼠腦缺血再灌注損傷中大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)