地氟醚預處理調節(jié)內皮細胞NF-kB振蕩.pdf

1、第一部分地氟醚預處理對臍靜脈內皮細胞缺氧/復氧損傷的保護作用
　　目的:分離培養(yǎng)原代人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)，研究地氟醚預處理對HUVECs缺氧/復氧損傷所起的保護作用。
　　方法:采用膠原酶灌注消化法分離培養(yǎng)HUVECs，以Ⅷ因子相關抗原免疫熒光方法進行鑒定。將細胞分為三組:對照組（CON組），缺氧/復氧組(A/R組)和地氟醚預處理組（De

2、sPC組），DesPC組在缺氧/復氧損傷前先給予30分鐘1MAC地氟醚處理。用異硫氰酸熒光素標記的重組膜粘連蛋白-5(AnnexinⅤ-FITC)和碘化丙啶(PI)標記，流式細胞儀計數凋亡細胞，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定細胞存活率，采用WST-1(water-soluble tetrazolium salt)法測定細胞內超氧化物歧化酶(SOD)活力。
　　結果:原代HUVECs生長5-7天后呈單層鋪路石樣排列，細胞為扁平多角形

3、，Ⅷ因子相關抗原檢測為陽性。A/R組細胞凋亡率（35.73±5.43％，均數±標準差）與CON組(23.62±4.56％)相比明顯增加，經過地氟醚預處理后，DesPC組細胞凋亡(27.39±3.22％)較A/R組明顯下降。DesPC組細胞存活率(96.58±6.25％)明顯高于A/R組(86.25±3.61％)。A/R組細胞內SOD活力(23.55±7.84U/mgprotein)較CON組(38.86±6.40U/mgprotein)

4、降低，DesPC組SOD活力(35.49±9.36U/mgprotein)與A/R組相比明顯增加。
　　結論:本實驗成功培養(yǎng)出原代HUVECs，建立了體外缺氧/復氧模型。地氟醚預處理抑制臍靜脈內皮細胞缺氧/復氧引起的細胞凋亡，保存細胞內超氧化物歧化酶活性，從而具有一定的抗缺氧/復氧損傷效應。
　　第二部分地氟醚預處理引起臍靜脈內皮細胞轉錄因子NF-κB振蕩和抗凋亡蛋白產生
　　目的:轉錄因子NF-κB參與調節(jié)吸入麻醉藥

5、物預處理引起的缺氧/復氧損傷保護作用。探討地氟醚預處理對HUVECs NF-κ B以及凋亡相關蛋白表達的影響，以明確地氟醚預處理對缺氧/復氧損傷的保護機制。
　　方法:選用原代培養(yǎng)的HUVECs，將細胞分成6組:對照組(CON組)，地氟醚組（DES組），缺氧/復氧組(A/R組)，地氟醚預處理組（DesPC組），BAY+DesPC組和BAY+A/R組，DesPC在A/R前給予30分鐘1MAC地氟醚處理，DES組給予地氟醚處理但不經歷

6、A/R損傷，BAY+DesPC組和BAY+A/R組分別在氣體處理前給予抑制劑BAY11-7082。利用annexinⅤ-FITC標記，流式細胞儀計數凋亡細胞以及MTT法測定細胞存活率。免疫熒光方法標記NF-κ B p65核轉運，Western blot方法測細胞凋亡抑制蛋白1(c-IAP1)、B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)、天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）、NF-kappa B抑制因子ⅠκBα和磷酸化NF-κ

7、B p65(p-p65)的表達量。
　　結果:免疫熒光方法顯示，對照組NF-κ B p65免疫熒光標記主要分布在胞漿區(qū)，DES組細胞在地氟醚處理結束后立即出現(xiàn)NF-κ B p65入核轉運。Westernblot方法檢測DES組ⅠκBα含量較對照組下降，磷酸化NF-κ B p65增加，A/R組與對照組相比磷酸化NF-κ B p65顯著增加。DesPC組經過地氟醚預處理的細胞ⅠκBα含量較A/R組增加，NF-κ B p65磷酸化減少，

8、同時c-IAP1、Bcl-2蛋白和caspase-3前體的蛋白含量也明顯增加。BAY+DesPC組和BAY+A/R組細胞存活率、凋亡率無明顯差異，細胞內ⅠκBα含量、NF-κ B p65磷酸化和caspase-3前體含量均無明顯差異。
　　結論:實驗結果顯示地氟醚在預處理階段激活NF-κB并且通過負反饋抑制復氧階段NF-κ B的過度激活。地氟醚引起的NF-κ B的振蕩最終上調了內皮細胞中抗凋亡蛋白的表達，從而產生對抗A/R損傷的保