rAAV9介導(dǎo)抗NF-kB核酶基因體外轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞及對(duì)NF-kB活性影響的研究.pdf

1、目的：研究9型重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)抗NF-kB核酶基因（rAAV9-EGFP-R65）對(duì)大鼠心肌H9C2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子-kB（NF-kB）活性的影響。方法：含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的9型重組腺相關(guān)病毒（rAAV9）按轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI）1×105、1×106、1×107v.g./cell轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察H9C2細(xì)胞中EGFp陽(yáng)性表達(dá)情況，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)rAAV9-EGFP對(duì)H9C2細(xì)胞

2、的轉(zhuǎn)染效率。觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，并用Alamar Blue法檢測(cè)rAAV9-EGFP對(duì)H9C2細(xì)胞增殖影響。同樣方法處理rAAV9-EGFP-R65（MOI=1×106v.g./cell）。以腫瘤壞死因子-a（TNF-a）、rAAV9-EGFP-R65及二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）處理H9C2細(xì)胞，凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)（EMSA）檢測(cè)NF-kB活性。結(jié)果：rAAV9-EGFP轉(zhuǎn)染后第1天，MOI=1×106、1×107組中EGFP開(kāi)

3、始表達(dá)，第2天，MOI=1×105組開(kāi)始表達(dá)，各組EGFP表達(dá)強(qiáng)度隨MOI值的增高而增強(qiáng)，同時(shí)EGFP的表達(dá)強(qiáng)度隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染后第4天達(dá)到高峰，此時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)rAAV9-EGFP對(duì)H9C2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率分別為MOI=1×105組：（14.1±0.2）%、MOI=1×106組：（35.1±4.8）%、MOI=1×107組：（56.8±0.1）%。rAAV9-EGFP-R65（MOI=1×106）轉(zhuǎn)染后第1天，EGFP開(kāi)始表

4、達(dá)，EGFP的表達(dá)強(qiáng)度隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染后第5天達(dá)到高峰，此時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率（32.27±3.19）%。rAAV9-EGFP及 rAAV9-EGFP-R65轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)正常，Alamar Blue法進(jìn)一步檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染組對(duì)H9C2細(xì)胞增殖無(wú)影響。常態(tài)下H9C2細(xì)胞NF-kB有一定活性，TNF-a刺激后NF-kB活性明顯增高，且TNF-a對(duì)H9C2細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，而rAAV9-EGFP-R65、PD