ICAM-1介導(dǎo)和NF-KB調(diào)控肝干細(xì)胞定向遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景卵圓細(xì)胞(ovalcells,OVCs)為存在肝臟組織中的能自我復(fù)制并具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，它既可以長期增殖，又可以分化為成熟肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。Peterson等研究表明，OVCs能來源于骨髓中造血干細(xì)胞(hemopoieticstemcells，HSCs)。OVCs在肝細(xì)胞發(fā)育、生長、增生及癌變等生理和病理生理過程中起著重要作用。正常情況下肝臟細(xì)胞處于靜止期，分裂增殖緩慢，OVCs極少被檢測到。當(dāng)肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷或肝細(xì)胞的

2、增殖受到抑制時(shí)，OVCs被激活，增殖，分化形成成熟肝細(xì)胞。肝臟嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，OVCs受自身狀態(tài)和微環(huán)境的調(diào)節(jié)，分化為成熟肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，但其分化方向不一定固定不變，有研究表明，OVCs在特定的自身狀態(tài)和微環(huán)境的調(diào)節(jié)下，可以分化為肝癌細(xì)胞。另有研究發(fā)現(xiàn)，肝損傷時(shí)，OVCs不僅出現(xiàn)在匯管區(qū)，而且還存在于肝小葉內(nèi)。匯管區(qū)的OVCs為什么會出現(xiàn)在肝小葉內(nèi)?是什么使OVCs發(fā)生遷移?Sammons等人發(fā)現(xiàn)，骨髓中原始造血干細(xì)胞表面存在一組以細(xì)胞間

3、粘附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)為主的粘附分子，能介導(dǎo)HSCs與骨髓基質(zhì)的粘附，從而使HSCs產(chǎn)生一種定向遷移的作用。慢性肝臟疾病或肝臟損傷時(shí)，肝組織中ICAM-1表達(dá)明顯增多。在對ICAM-1和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞ICAM-1呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而正常肝細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)為陰性。上述研究表明ICAM-1和HCC有著密切關(guān)系，但兩者之間具體是如何相互影

4、響的?ICAM-1在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中起著什么作用?對此我們還不清楚。我們設(shè)想，既然OVCs可以來源于HSCs，并且HSCs表達(dá)ICAM-1，那么OVCs也應(yīng)表達(dá)ICAM-1；ICAM-1能介導(dǎo)HSCs與骨髓基質(zhì)的粘附，從而使HSCs產(chǎn)生一種定向遷移的作用，那么ICAM-1是否也能介導(dǎo)OVCs與肝細(xì)胞間基質(zhì)的粘附，并使OVCs定向遷移?本研究就是依據(jù)上述理論和設(shè)想而設(shè)計(jì)的，以探討ICAM-1在肝硬化和HCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

5、 目的建立肝損傷、OVCs增殖動物模型，觀察ICAM-1在肝損傷不同時(shí)期的分布；分離、純化OVCs，探討OVCs對ICAM-1的表達(dá)和NF-κB對ICAM-1表達(dá)的調(diào)控；并進(jìn)一步探討ICAM-1和NF-κB在OVCs定向遷移中的作用，為臨床肝硬化和HCC的防治尋找新的途徑。 方法1、建立動物模型三周齡Wistar大鼠共64只，雌雄不限。常規(guī)飼養(yǎng)1周后，連續(xù)飼喂含0.06％致癌劑3'-甲基-4-二甲基偶氮苯(3'-Me-D

6、AB)飼料，正常飲水，擬建立肝損傷動物模型。分別在誘癌2、4、6、8、10、12周后各在戊巴比妥鈉腹腔麻醉下切取約0.5×0.5×0.2cm3大小肝組織標(biāo)本于10％中性福爾馬林固定。同時(shí)，在4、6、8w取肝組織標(biāo)本時(shí)另取1mm3大小的肝組織標(biāo)本，于2％戊二醛固定，超薄切片，透射電鏡觀察。另取誘癌4周的大鼠行Percoll密度梯度離心法分離OVCs。 2、ICAM-1定位實(shí)驗(yàn)取誘癌2、4、6、8、10、12周后損傷肝組織標(biāo)本行以下

7、實(shí)驗(yàn)： (1)常規(guī)病檢，觀察肝組織病理變化，重點(diǎn)觀察肝組織內(nèi)OVCs的分布情況； (2)透射電鏡下觀察OVCs和周圍組織的生長情況； (3)對肝組織行ICAM-1免疫組化檢查，初步觀察ICAM-1在肝組織內(nèi)的分布情況。 3、Procell梯度密度離心法分離、純化OVCs，對OVCs行ICAM-1免疫組化檢測，確切觀察ICAM-1在OVCs中的表達(dá)。 4、NF-κB對ICAM-1表達(dá)的調(diào)控將OVCs

8、分為A、B、C三組，A組為OVCs的單獨(dú)培養(yǎng)，未加任何干預(yù)因素；B組加入NF-κB激活劑TNF-a干預(yù)；C組加入NF-κB抑制劑TGF-β1干預(yù)，每組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)亞組，于培養(yǎng)后第3、6、9、12天行以下實(shí)驗(yàn)： (1)觀察在不同干預(yù)條件下單獨(dú)培養(yǎng)系內(nèi)OVCs的生長情況，并計(jì)數(shù)； (2)用RT-PCR技術(shù)對單獨(dú)培養(yǎng)系內(nèi)的OVCs行ICAM-1mRNA半定量分析，觀察不同干預(yù)條件下OVCs對ICAM-1的表達(dá)情況；

9、 5、OVCs與Ito細(xì)胞的混合培養(yǎng)，未加任何干預(yù)因素，光鏡下觀察混合培養(yǎng)系內(nèi)的OVCs和Ito細(xì)胞粘附生長情況。 結(jié)果1、肝組織ICAM-1免疫組化顯示：肝損傷初期，ICAM-1主要分布在匯管區(qū)，隨著肝損傷逐漸加重，ICAM-1表達(dá)增多，并向肝小葉擴(kuò)散。這和相關(guān)報(bào)導(dǎo)的肝損傷時(shí)OVCs分布情況相吻合。 2、電鏡下見肝OVCs核大，核漿比高，核仁明顯，胞漿內(nèi)細(xì)胞器少，僅見小的線粒體和少量內(nèi)漿網(wǎng)，細(xì)胞呈幼稚、未分化狀態(tài)；

10、 3、OVCsICAM-1免疫細(xì)胞化學(xué)檢測明顯陽性； 4、單獨(dú)培養(yǎng)系細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示：與對照組比較，TNF-α促進(jìn)OVCs的增殖，P＜0.01，TGF-β1對OVCs的增殖能力無明顯影響，P＞0.05； 5、RT-PCR技術(shù)對單獨(dú)培養(yǎng)系內(nèi)的OVCs行ICAM-1mRNA半定量分析顯示：對照組、TNF-α組和TGF-β1組ICAM-1mRNA相對灰度值分別是0.480、0.752和0.403，TNF-α組ICAM-1m

11、RNA表達(dá)較對照組增強(qiáng)，而TGF-β1組ICAM-1mRNA表達(dá)較對照組減弱； 6、光鏡下連續(xù)觀察混合培養(yǎng)系內(nèi)的OVCs和Ito細(xì)胞粘附生長情況顯示：混合培養(yǎng)第二天，OVCs向肝星狀細(xì)胞周圍聚集，第三天可見OVCs與肝星狀細(xì)胞明顯粘附生長。 結(jié)論1、在損傷肝組織標(biāo)本中ICAM-1的分布與OVCs的分布一致； 2、在肝損傷肝組織中OVCs表達(dá)ICAM-1； 3、TNF-α和TGF-β1分別通過對NF-κB活