PlexinA3介導少突膠質前體細胞遷移的實驗研究.pdf

1、少突膠質前體細胞(Oligodendrocyteprecursorcells,OPCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)中存在并廣泛分布的一類膠質細胞,它可以分化成熟為少突膠質細胞和星形膠質細胞,其遷移活動對CNS的發(fā)育、損傷修復與功能重建,以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病如多發(fā)性硬化(multiplesclerosis,MS)等的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮著非常重要的作用。近年來的研究認為CNS損傷修復過程中神經(jīng)纖維的

2、脫髓鞘反應以及髓鞘的修復與再生障礙是制約神經(jīng)損傷修復結局與功能重建的重要原因,而成功的髓鞘修復與再生則極有可能成為改善這一困難局面的重要環(huán)節(jié)。因此,研究髓鞘的形成機制與相關的調節(jié)因素成為CNS損傷修復研究領域的熱點問題。眾所周知,CNS髓鞘的形成在胚胎時期主要是由少突膠質細胞完成,然而在機體成熟以后,少突膠質細胞是否具有修復與再生髓鞘的能力尚無確切的結論。近來的研究發(fā)現(xiàn),由OPCs分化形成的少突膠質細胞(Oligodendrocyte,

3、OL)具有再生和形成髓鞘的能力。體外實驗發(fā)現(xiàn),將OPCs與胚胎脊髓共組織培養(yǎng),OPCs能夠分化形成OL并為新生的神經(jīng)纖維形成髓鞘;在脊髓損傷的研究中發(fā)現(xiàn),OPCs能夠從脊髓的腹側遷移到背側,部分細胞能在損傷灶周圍分化形成OL;同樣,在對MS的研究中也發(fā)現(xiàn),脫髓鞘病灶的周圍有大量NG2染色陽性的OPCs,進一步的研究發(fā)現(xiàn),這些NG2陽性細胞主要是從室管膜下區(qū)遷移而來;這些研究都有力的提示OPCs的確參與了CNS損傷與修復的過程,并且很可能

4、在這個過程中扮演了十分重要的角色。為此,研究OPCs的發(fā)育成熟規(guī)律、遷移機制以及相關因素成為闡明上述問題的重要內容。
　　眾所周知,細胞的遷移不僅取決于細胞本身的特性,而且受眾多環(huán)境因素的影響,如細胞基質蛋白、層粘連蛋白等,環(huán)境中的離子含量變化、甚至pH變化也可能對細胞的遷移產(chǎn)生影響。近年來尤其引人關注的是各種細胞因子對細胞遷移的作用。因為,環(huán)境因素可以通過多種措施加以控制和調節(jié),并能在特定的條件下得到穩(wěn)定,而細胞因子通常需要與特

5、定的細胞受體結合,并通過一系列的細胞內過程才能實現(xiàn),作用的機制更加復雜而多變;更為重要的是,細胞因子的遷移誘導作用具有定向性,信號過程的傳遞、濃度梯度的變化等均可以造成細胞的定向遷移。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn),軸突誘導因子Semaphorins家族成員不僅對再生軸突的生長具有誘導作用,而且對OPCs的遷移也有誘導作用。陳煥然博士的研究發(fā)現(xiàn)Semaphorins家族成員Sema3A對OPCs遷移具有誘導作用,其作用機制與RhoG信號通路相

6、關分子的變化有關;而對軸突定向延伸作用更明顯的Sema3F是否也有類似的作用?尚無相關的文獻報道。新近的研究發(fā)現(xiàn)sema3與多種腫瘤細胞的遷移有關,而此誘導遷移的功能的實現(xiàn)需要與其受體分子NRP2/plexinA3復合體共同參與,方能激活相應的細胞內信號傳導鏈,從而誘導細胞遷移。既然PlexinA3及神經(jīng)菌毛素2(neuropilin2,NRP2)作為sema3F的特異性受體,介導sema3F的在多種細胞內信號傳導,在細胞的遷移活動中發(fā)

7、揮重要的調節(jié)作用,Sema3F對OPCs是否也具有類似的誘導作用?其作用是否同樣是通過NRP2/plexinA3介導,以上問題尚未見類似報道。作者在前期預實驗中通過Transwell遷移倉實驗研究發(fā)現(xiàn),Sema3F的確對OPCs的定向遷移具有誘導作用。如果能夠在OPCs上發(fā)現(xiàn)plexinA3及其NRP2的表達,無疑對解釋上述現(xiàn)象并認識OPCs的遷移機制具有重要意義。因此,我們設計實驗對以上問題進行了研究:首先于體外分離培養(yǎng)及純化OPCs

8、,并誘導其向成熟少突膠質細胞分化,通過RT-PCR、Westernblot、免疫組化、免疫熒光染色等手段,研究plexinA3在OPCs不同分化階段上的表達與特點;其次,在此基礎上,通過分子生物學手段調控plexinA3在OPCs中的表達,觀察plexinA3表達變化對Sema3F誘導OPCs遷移的影響,最后從上述研究結果中,闡明plexinA3在Sema3F誘導OPCs遷移中的作用,為深入研究OPCs定向遷移的機制奠定實驗基礎。研究結

9、果如下:
　　第一部分(第二章內容):PlexinA3在OPCs不同分化階段的表達
　　采用振蕩分離法體外分離培養(yǎng)新生大鼠OPCs,并觀察了bFGF及PDGF-AA誘導OPCs增殖與分化的作用,采用NG2、O4及MBP抗體檢測OPCs不同分化階段細胞的表達;在此基礎上,通過RT-PCR,Westernblot、免疫熒光雙標檢測并分析plexinA3及NRP2在OPCs不同分化階段細胞中的表達與特點,主要結果如下:
　　

10、1.振蕩分離法分離新生大鼠OPCs,方法簡單、穩(wěn)定、可靠,獲得的OPCs純度高,通過二次接種培養(yǎng)即可達到滿足實驗所需純度及數(shù)量的OPCs;bFGF及PDGF-AA能誘導OPCs的增殖與分化,NG2,O4及MBP免疫組化染色可識別到OPCs不同分化的細胞階段;
　　2.在OPCs階段,即(NG2+染色陽性階段)及未成熟階段(即O4+染色陽性階段),plexinA3高表達,當OPCs分化成熟為OL后(即MBP+染色陽性階段)其表達明顯

11、下調。作為協(xié)同受體的NRP2在OPCs分化過程中的表達特點與plexinA3類似;但從Westernblot及RT-PCR等方法的檢測結果觀察,在OPCs各分化階段,NRP2的表達水平較plexinA3稍高,推測可能與其具有結合多種協(xié)同受體的特殊功能有關;
　　3.PlexinA3及NRP2均主要表達于OPCs及未成熟的少突膠質細胞的細胞膜及突起上,提示二者可能OPCs的誘導遷移有關。
　　第二部分(第三章內容):plexi

12、nA3對sema3F誘導OPCs遷移的影響
　　第一部分研究證實plexinA3及NRP2表達在OPCs的細胞膜及細胞突起上,并均出現(xiàn)在OPCs階段及未成熟階段,故推測其可能參與了Sema3F介導的OPCs遷移的調控。為此,本部分實驗擬通過siRNA干擾技術調節(jié)plexinA3及NRP2在OPCs中的表達水平,通過干擾其表達后觀察Sema3F誘導OPCs遷移的改變,從而證實plexinA3在sema3F誘導OPCs遷移中的作用。首

13、先分別設計了plexinA3及NRP2的siRNA,利用MTT實驗檢測plexinA3siRNA及NRP2siRNA對OPCs生存能力的影響,確認其無細胞毒性后,采用RT-PCR技術分別檢測兩種siRNA的干擾效果,達到實驗要求后,利用脂質體介導基因轉染技術,將plexinA3siRNA及NRP2siRNA分別轉染OPCs,通過Transwell遷移倉實驗,比較下調plexinA3及NRP2表達后,sema3F誘導OPCs遷移的變化,藉

14、此闡明plexinA3及NRP2在OPCs遷移中的作用。主要實驗結果如下:
　　1.MTT試驗結果證實,使用合成的plexinA3siRNA及NRP2siRNA濃度在0.125~2.00μg/μl范圍內對OPCs沒有明顯的細胞毒性作用;
　　2.脂質體介導plexinA3siRNA及NRP2siRNA轉染OPCs后,通過TR-PCR檢測,二者能分別有效地抑制OPCs表達plexinA3及NRP2,其抑制效率可達64~79％;

15、
　　3.Trenswell遷移倉實驗證實Sema3F對OPCs具有誘導遷移作用,加入plexinA3siRNA后,OPCs的遷移率明顯降低,加入NRP2siRNA后,OPCs的遷移率下降更加明顯,兩者相比具有統(tǒng)計學差異,提示NRP2-siRNA的抑制效果更加明顯。
　　以上結果說明,sema3F對于OPCs具有誘導遷移作用,plexinA3及NRP2作為sema3F誘導作用的協(xié)同受體共同參與了其對OPCs遷移過程的調控,相