神經(jīng)母細(xì)胞瘤B104細(xì)胞株條件培養(yǎng)基促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、目的：鑒定介導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤 B104細(xì)胞株條件培養(yǎng)液(B104 neuroblatoma cells conditioned medium, B104CM)中誘導(dǎo)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)增殖的關(guān)鍵因子，并探討B(tài)104CM誘導(dǎo)OPCs增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法：（1）培養(yǎng)B104神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，離心過(guò)濾收集條件培養(yǎng)液。（2）手術(shù)分離取出 E16天 SD大鼠

2、胎鼠的脊髓，消化分離細(xì)胞，以免疫粘附法得到純化的OPCs，進(jìn)行原代培養(yǎng)。（3）用免疫熒光染色法標(biāo)記OPCs特異性標(biāo)志物鑒定OPCs。（4）將不同濃度的B104CM(0，10％，30%，50%，100%)加入到無(wú)生長(zhǎng)因子的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)物中，以BrdU摻入染色法結(jié)合A2B5染色鑒定OPCs的增殖。（5）以逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測(cè)PDGF-AA、bFGF和IGF-1 mRNA在B104細(xì)胞的表達(dá)，以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme lin

3、ked immunosorbent assay,ELISA）檢測(cè)B104CM中 PDGF-AA、bFGF和 IGF-1的蛋白含量，通過(guò)免疫熒光染色來(lái)驗(yàn)證 PDGFR、FGFR2和IGFR在OPCs上的表達(dá)，篩選出可能促進(jìn)OPCs增殖的候選生長(zhǎng)因子。（6）應(yīng)用生長(zhǎng)因子受體的特異性抑制劑觀察B104CM中候選生長(zhǎng)因子對(duì)OPCs增殖的影響，最終鑒定出B104CM中影響OPCs增殖的關(guān)鍵因子。（7）蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)E

4、rk1/2、PI3K、p38和JNK在B104CM誘導(dǎo)OPCs增殖中的活化（磷酸化）。（8）RT-PCR和Real-time-PCR法檢測(cè)B104CM誘導(dǎo)OPCs增殖過(guò)程中可能涉及的立早基因和細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：（1）成功分離、培養(yǎng)出OPCs，其純度高達(dá)95%以上。（2）BrdU摻入法結(jié)合A2B5染色證實(shí)B104CM可誘導(dǎo)OPCs的增殖。（3）RT-PCR結(jié)果證明B104細(xì)胞表達(dá)PDGF-AA、bFGF和IGF-1

5、 mRNA，ELISA檢測(cè)到PDGF-AA、bFGF和IGF-1三種生長(zhǎng)因子在無(wú)濃縮的B104CM中的濃度分別達(dá)到23.42±4.28、12.94±3.05和7.21±2.12 ng/ml；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn) OPCs表達(dá) PDGFR、FGFR和 IGFR。（4） PDGFR、FGFR信號(hào)的抑制劑AG1295和PD173074顯著降低B104CM誘導(dǎo)的OPCs增殖，但I(xiàn)GFR的抑制劑無(wú)明顯影響。（5）Western Blot結(jié)果證明，B1

6、04CM誘導(dǎo)OPCs內(nèi)Erk1/2和JNK的活化（磷酸化）；Erk1/2的抑制劑U0126和JNK的抑制劑 SP600125均可顯著降低 B104CM誘導(dǎo) OPCs增殖。（6）RT-PCR結(jié)果證明， B104CM可刺激立早基因c-fos、c-jun、Id-2和細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、D2、E表達(dá)的增加，且Erk抑制劑可抑制其表達(dá)。（7）B104CM刺激立早基因c-jun，c-fos， c-myc表達(dá)的增加，但降低SMAD4和AT

7、F-2的表達(dá)，且JNK抑制劑可分別抑制和恢復(fù)其表達(dá)。
　　結(jié)論：1. PDGF-AA和bFGF是介導(dǎo)B104CM誘導(dǎo)OPCs增殖的關(guān)鍵因子。2. Erk1/2信號(hào)通路的激活是B104CM誘導(dǎo)OPCs增殖的關(guān)鍵分子事件，B104CM激活Erk1/2信號(hào)通路，并啟動(dòng)下游立早基因c-jun，c-fos，Id-2和細(xì)胞周期蛋白cyclin D1，cyclin D2和cyclin E等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，啟動(dòng)OPCs的增殖。3. JNK信號(hào)通路