調(diào)控ROCK通路對氧糖剝奪后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、本文主要從以下兩個部分展開論述：
　　第一部分 大鼠腦少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定
　　目的：探索SD大鼠腦少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）的分離與體外培養(yǎng)方法，觀察其體外生長、標(biāo)志物表達及定向分化能力。
　　方法：取出生后3天內(nèi)SD大鼠全腦，采用0.125％的胰蛋白酶消化后培養(yǎng)10天左右，獲得原代混合膠質(zhì)細(xì)胞，在恒溫?fù)u床180rpm振搖過夜并差速貼壁40

2、分鐘獲得純化的OPCs。采用少突膠質(zhì)前體細(xì)胞標(biāo)志物A2B5和NG2抗體對純化后培養(yǎng)3天的細(xì)胞進行免疫熒光染色鑒定OPCs細(xì)胞純度，并取OPCs誘導(dǎo)分化3天后進行少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白MBP及O4的免疫熒光染色。
　　結(jié)果：采用胰蛋白酶消化法獲取原代混合膠質(zhì)細(xì)胞、振搖并差速貼壁法分離純化能夠得到純度較高的OPCs，呈雙極或三極形態(tài)，折光性強，免疫熒光染色顯示95％細(xì)胞表達A2B5和NG2，經(jīng)誘導(dǎo)分化后可表達MBP及O4。
　　結(jié)

3、論：采用振搖并差速貼壁法自SD大鼠全腦可分離純化獲得純度較高的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，體外生長穩(wěn)定，經(jīng)誘導(dǎo)可分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞。
　　第二部分 調(diào)控ROCK通路對氧糖剝奪后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖和分化的影響
　　目的：觀察ROCK信號通路特異性抑制劑Y27632對氧糖剝奪（Oxygen-glucose deprivation,OGD）后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖和分化的影響。
　　方法：培養(yǎng)SD大鼠的全腦少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，實驗

4、分為Control組、Control+Y27632組、OGD組、OGD+ Y27632組四組；對細(xì)胞進行OGD處理2h，取再灌后0h、3h、6h、12h、24h時間點，進行MTT檢測細(xì)胞增殖活性，EDU檢測S期細(xì)胞比例，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期的分布，western blot檢測OPCs細(xì)胞p-ERK1/2、p-P38和p-JNK的表達情況，探討干預(yù)后增殖情況及其機制。對細(xì)胞進行OGD處理2h，取4天后時間點，進行免疫熒光組化染色和

5、western blot實驗，檢測細(xì)胞MBP蛋白表達情況，從而探討干預(yù)后分化情況。
　　結(jié)果：與對照組相比，OGD組OPCs細(xì)胞增殖活性下降（6h和12h,P<0.01），同時處于S期細(xì)胞的百分率明顯降低（0h、3h、6h和12h, P<0.01）；OGD+Y27632組相比于OGD組OPCs細(xì)胞增殖活性上升（6h和12h,P<0.01），同時處于S期細(xì)胞的百分率明顯上升（0h、3h、6h和12h, P<0.01）。
　　O

6、GD組p-ERK1/2表達量明顯高于對照組（3h、6h和24h，P<0.01），p-P38表達量明顯低于對照組（0h、3h和6h，P<0.05），p-JNK無明顯變化；與OGD組相比，OGD+Y27632組p-ERK1/2表達量明顯降低（3h、6h和24h，P<0.01），p-P38表達量明顯增高（0h、3h和6h，P<0.05），p-JNK無明顯變化。
　　與對照組相比，OGD組表達少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白MBP量明顯增多（4d，

7、P<0.01）；OGD+Y27632組比單純OGD組表達少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白MBP的量進一步增加（4d，P<0.01）。
　　結(jié)論：氧糖剝奪后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖下降，Y27632特異性抑制ROCK信號通路促進氧糖剝奪后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖，提示ROCK信號通路參與了少突膠質(zhì)前體細(xì)胞氧糖剝奪后增殖過程。同時MAPK信號通道中ERK1/2和P38的蛋白磷酸化參與ROCK信號通路對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖的調(diào)控。
　　氧糖剝奪