CXCL12-CXCR4對大鼠少突膠質(zhì)前體細胞遷移的影響及其機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　脊髓損傷(SCI)目前缺乏有效的治療手段，主要困難有:殘存神經(jīng)細胞的存活、軸突再生、殘存軸突的再髓鞘化、再生軸突的生長方向不確定、以及如何重新構(gòu)建有功能的軸突聯(lián)系。SCI大部分是不完全橫斷損傷，但是在物理和化學作用下，局部缺血、缺氧，損傷區(qū)域可能進入多種炎性因子，細胞死亡和凋亡等級聯(lián)效應被觸發(fā)，可以造成殘存神經(jīng)系統(tǒng)的繼發(fā)性損傷。損傷脊髓局部因此普遍存在殘存軸突脫髓鞘的病理改變，有些患者在數(shù)十年后，軸突脫髓鞘變化仍

2、然存在，使殘存軸突不能發(fā)揮作用。這些不利因素一直困擾著醫(yī)學工作者。
　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷修復過程中，作為少突膠質(zhì)細胞主要來源的少突膠質(zhì)前體細胞(Oligodendrocyte Precursor Cells，OPCs)在一系列信號（如PDGF、netrin-1）誘導下可以遷移到相應的中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突，然后分化成成熟的髓鞘少突膠質(zhì)細胞，發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷修復的功能。大量研究表明:趨化因子及其受體在腫瘤細胞和正常細胞的

3、遷移中發(fā)揮重要作用。并且已有研究表明，CXCL12可以通過CXCR4調(diào)控OPCs的遷移、增殖和分化來促進損傷脊髓的修復和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，但也有研究發(fā)現(xiàn)CXCL12/CXCR4不能調(diào)控OPCs的遷移。而在膽管癌細胞和成熟樹突細胞中發(fā)現(xiàn)CXCL12/CXCR4可以通過AKT和MEK1/2通路調(diào)控其存活和趨化性。目前CXCL12/CXCR4對少突膠質(zhì)前體細胞遷移的影響研究還遠未明晰，且其機制尚不清楚。因此，本研究擬通過體外實驗檢測CXCL

4、12/CXCR4對少突膠質(zhì)前體細胞遷移的影響及AKT和MEK1/2通路在其中的重要角色，以期為脊髓損傷修復提供一定的實驗基礎。
　　方法：
　　1.利用振蕩分離和差速貼壁等方法分離、培養(yǎng)新生48 h的SD大鼠大腦皮層組織中的OPCs，并根據(jù)OPCs表面標記PDGFR-α及成熟少突膠質(zhì)細胞標記O4、MBP三個指標進行免疫熒光實驗鑒定分離的OPCs及誘導分化中期和晚期的成熟少突膠質(zhì)細胞。
　　2.通過boyden cham

5、ber小室檢測在不同濃度的CXCL12(0 ng/ml、5 ng/ml、10ng/ml、20 ng/ml)作用下對大鼠OPCs處理48h后其遷移能力的變化，利用Westernblotting實驗檢測相應條件下CXCR4及MEK1/2與PI3K通路中ERK、p-ERK、AKT和p-AKT蛋白表達的變化。
　　3.通過CXCR4shRNA抑制大鼠OPCs中CXCR4蛋白表達，利用Western blotting實驗檢測CXCL12(2

6、0 ng/ml)作用條件下大鼠OPCs中CXCR4及MEK1/2與PI3K通路蛋白ERK、p-ERK、AKT和p-AKT表達的變化。利用boyden chamber小室檢測相應條件下大鼠OPCs遷移能力的變化。
　　4.分別通過LY294002阻斷PI3K通路、U0126阻斷MEK1/2通路、LY294002和U0126同時阻斷PI3K和MEK1/2通路，利用Western blotting實驗檢測CXCL12(20ng/ml)作

7、用條件下大鼠OPCs中MEK1/2和PI3K通路蛋白ERK、p-ERK、AKT和p-AKT表達的變化，通過boyden chamber小室檢測大鼠OPCs遷移能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1.利用振蕩分離和差速貼壁等方法可以大量獲得原代OPCs，其胞體呈近圓形，
　　胞體周圍具有纖細的兩極或三極細胞突起，經(jīng)免疫細胞化學檢測結(jié)果顯示上述方法分離的原代OPCs特異性表達PDGFR-α，比例達95％。OPCs經(jīng)誘導成成熟少突

8、膠質(zhì)細胞后，誘導中期O4表達呈陽性，其胞體呈圓形，胞體周圍纖細突起增多;誘導晚期MBP表達呈陽性，細胞周圍有很多纖細的突起，向四周放射呈網(wǎng)狀。
　　2.OPCs在不同濃度的CXCL12作用下處理48h后，隨著CXCL12濃度的提高
　　大鼠OPCs的遷移能力逐漸增強，CXCL12濃度為20 ng/mL時促進作用最明顯(p＜0.05)，達到對照組的3.64倍。Western bLotting實驗結(jié)果顯示:CXCR4、p-ERK

9、、p-AKT蛋白表達隨著CXCL12濃度的提高逐漸增加，CXCL12濃度為20 ng/ml時增加最明顯(p＜0.05);而ERK、AKT蛋白的表達沒有明顯的變化(p＞0.05)。
　　3.通過CXCR4shRNA抑制CXCR4蛋白表達后，與對照組相比，CXCL12(20ng/ml)對大鼠OPCs遷移的促進作用受到明顯抑制(P＜0.05)，并且PI3K和MEK1/2通路蛋白ERK和AKT磷酸水平也受到明顯抑制(P＜0.05，P＜0.

10、05)。
　　4.分別用LY294002阻斷PI3K通路和U0126阻斷MEK1/2通路，與對照組相比，CXCL12對大鼠OPCs遷移的促進作用均受到明顯抑制（P＜0.05，P＜0.05）;LY294002和U0126同時阻斷PI3K和MEK1/2通路后，與對照組相比，CXCL12對大鼠OPCs遷移的促進作用受到更加明顯的抑制（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.本研究通過振蕩分離和差速貼壁等方法可以大量獲得原代OP