Nogo-A、NgR及RhoA在未成熟大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞系的表達(dá)和缺氧缺糖后的表達(dá)及意義.pdf

1、全文分為三部分： 第一部分：未成熟大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞系的分離、培養(yǎng)及鑒定 目的：獲取高純度的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞系，并作鑒定，為進(jìn)一步研究作細(xì)胞準(zhǔn)備。 方法：出生2日齡的SD大鼠，無菌條件下斷頭取腦，剔除腦膜及血管。根據(jù)星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞系生長的時(shí)間差異，細(xì)胞的粘附特性不同，利用振蕩分離純化法獲得純化的大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，再用添加了N2、PDGF、bFGF的無血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。分別用少突膠質(zhì)前體細(xì)胞

2、系不同發(fā)育階段的特異性抗體：A285、04、01，采用免疫熒光法對(duì)表面抗原進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 結(jié)果：獲得純度95％以上的未成熟SD大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，少突膠質(zhì)祖細(xì)胞A285、04抗體陽性；未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞04、01陽性。 結(jié)論：通過振蕩分離純化法及結(jié)合少突膠質(zhì)細(xì)胞定向培養(yǎng)基是培養(yǎng)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的可靠方法；N2、PDGF、bFGF的添加可以顯著提高細(xì)胞的產(chǎn)量，并使細(xì)胞保持在未成熟階段。 第二部分 ：未成熟大鼠少突

3、膠質(zhì)前體細(xì)胞系缺氧缺糖損傷后的變化 目的：建立未成熟大鼠少突膠質(zhì)前體系細(xì)胞缺氧缺糖損傷模型，并觀察缺氧不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的變化。 方法：體外分離純化培養(yǎng)未成熟SD大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞系(OLPs)并鑒定(同第一部分)。缺氧缺糖模型組(oxygen & glucosedeprivation，OGD)選擇A285或04或01表面抗體標(biāo)記陽性的細(xì)胞(即晚期OL前體和未成熟OL，OLPs)，使用耗氧劑連二亞硫酸鈉(Na<,2>S<,

4、2>O<,4>)及無糖Earle’s液制造OGD環(huán)境，細(xì)胞分別在此環(huán)境下培養(yǎng)10min、30min、60min及90min，并設(shè)立成熟OL OGD對(duì)照組和OLPs正常(無OGD)對(duì)照組。觀察各組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)光鏡、電鏡下形態(tài)的改變；MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞存活率；DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察各組少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡百分率。 結(jié)果：(1)加入Na<,2>S<,2>O<,4>濃度為10mmol/L時(shí)，無糖培養(yǎng)基中氧分壓在90m

5、in內(nèi)保持無氧或低氧，故選擇該濃度為制作OGD模型的適當(dāng)濃度。(2)光鏡下，模型組OGD10min出現(xiàn)胞體水腫；30min即出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞死亡和凋亡，胞體水腫，胞膜破裂，軸突腫脹，斷裂；正常對(duì)照組和成熟OL組細(xì)胞形態(tài)變化不明顯。(3)MTT結(jié)果顯示模型組OGD30min，細(xì)胞存活率降至75％；OGD90min，細(xì)胞存活率降至約50％。明顯低于正常對(duì)照組和成熟OL組(P均<0.05)。(4)DAPI染色顯示，模型組OGD10min即出現(xiàn)

6、細(xì)胞凋亡，隨著OGD時(shí)間的延長，凋亡細(xì)胞百分率逐漸增加，OGD60min，凋亡細(xì)胞百分率接近50％，模型組細(xì)胞凋亡百分率明顯高于正常對(duì)照組和成熟OL組(P均<0.05)。 結(jié)論：OGD導(dǎo)致OLPs形態(tài)學(xué)損傷，細(xì)胞存活率下降及凋亡率增加，同時(shí)表明OLPsOGD模型(OGD模型)建立成功，證實(shí)了OLPs對(duì)缺氧損傷的成熟依賴性。 第三部分：Nogo-A、NGR及RHOA在未成熟大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞及其缺氧缺糖模型中的表達(dá)及意義

7、 目的：觀察Nogo-A、NgR及RhoA在未成熟大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞系(OLPs)的表達(dá)和細(xì)胞定位，以及缺氧缺糖損傷后的表達(dá)，探討它們?cè)贠LPs系損傷后再生抑制中的作用。 方法：采用改良振蕩分離純化法體外培養(yǎng)OLPs(同第一部分)；用含連二亞硫酸鈉的無糖培養(yǎng)基模擬造成OLPsOGD模型(同第二部分)。用OLPs特異性抗體A285、04、01和MBP進(jìn)行免疫熒光法作細(xì)胞鑒定。然后在相應(yīng)的OLPs分化階段和分別在OOD不同

8、時(shí)段：10min、30min、60min用免疫熒光法和免疫印跡法觀察Nogo-A、NgR及RhoA的表達(dá)。 結(jié)果：Nogo-A、NgR、RhoA在OLPs分離純化培養(yǎng)后的第1、2和4天均有陽性表達(dá)，且隨細(xì)胞成熟度增加而表達(dá)增強(qiáng)，Nogo-A、NgR的陽性信號(hào)位于胞體及突起；RhoA的陽性信號(hào)位于胞漿及突起。Nogo-A在OLPs缺氧缺糖10min表達(dá)較正常對(duì)照組增強(qiáng)，30min繼續(xù)增高，60min最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

9、05)； NgR在OLPs缺氧缺糖后10min，表達(dá)較正常對(duì)照明顯增強(qiáng)，30min達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，60min降低，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)：RboA在OGD后10min，表達(dá)較正常顯著增強(qiáng)，且迅速達(dá)最高峰，OGD后30min，RhoA表達(dá)逐漸減弱， 60min繼續(xù)下降，但RhoA表達(dá)均正常對(duì)照組顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。 結(jié)論：在OLPs胞體及突起上均表達(dá)N