支持細(xì)胞條件培養(yǎng)基對精原干細(xì)胞增殖與凋亡影響的研究.pdf

1、精原干細(xì)胞可以維持自身的增殖以及分化為不同的生殖細(xì)胞，是自然狀態(tài)下出生后個體內(nèi)在整個生命期間能夠進(jìn)行自增殖并能將基因傳遞至子代的惟一成體干細(xì)胞。精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)是研究生精過程及其影響因素的重要手段，優(yōu)化精原細(xì)胞的培養(yǎng)條件、規(guī)范細(xì)胞培養(yǎng)程序、闡明精原細(xì)胞在體外培養(yǎng)中細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)特性的變化規(guī)律，是進(jìn)一步深入研究的重要基礎(chǔ)。但是精原干細(xì)胞在體外存活和增殖受到許多因素的影響，體外培養(yǎng)的條件以及某些基因方面的研究還不是

2、十分明了，因此，有必要對精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體條件以及其對增殖、凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響作一下研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用組合酶消化、選擇性貼壁的方法，分離得到了純度較高的小鼠睪丸精原干細(xì)胞；并設(shè)計了條件培養(yǎng)基、GDNF處理培養(yǎng)基以及對照培養(yǎng)基三種體系培養(yǎng)精原細(xì)胞。在一定的時間內(nèi)培養(yǎng)精原細(xì)胞，應(yīng)用CASY細(xì)胞活力分析儀、激光共聚焦顯微鏡等技術(shù)檢測了精原干細(xì)胞數(shù)量及活性，精原干細(xì)胞標(biāo)志物c-kit受體蛋白，并輔助以堿性磷酸酶染色鑒定；檢

3、測細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）和Bcl-2家族蛋白Bax（Homo sapiens Bcl-2 associated protein）、Bcl-2(B-cell leulcemia-lymphoma 2)的表達(dá)變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：
　　 1.應(yīng)用組合酶消化、選擇性貼壁分離純化的方法，分離得到的小鼠精原細(xì)胞的純度達(dá)到70％以上。
　　 2.應(yīng)用細(xì)胞活力分析儀測定細(xì)胞培養(yǎng)過程的數(shù)量及活性，表明細(xì)胞在體外培養(yǎng)時期

4、，細(xì)胞的增殖高峰分別在培養(yǎng)的第三天以及第七天，其中條件培養(yǎng)基組細(xì)胞增殖數(shù)量高于GDNF處理組；在培養(yǎng)的第七天，GDNF處理組與對照組相差不大。
　　 3.應(yīng)用堿性磷酸酶染色及c-kit受體蛋白檢測方法鑒定了培養(yǎng)的精原干細(xì)胞。
　　 4.激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的第一天，條件培養(yǎng)基組Bax、Bcl-2、PCNA的表達(dá)與GDNF處理組相差不大；條件培養(yǎng)基組和GDNF處理組與對照組相比，Bax的信號較弱，Bcl-2

5、的信號較強(qiáng)；PCNA信號較強(qiáng)。說明在培養(yǎng)的初期條件培養(yǎng)基組與GDNF處理組差別不大，培養(yǎng)狀態(tài)均好于對照組。
　　 5.在培養(yǎng)的第三天，條件培養(yǎng)基與GDNF處理組Bax的表達(dá)低于對照組，條件培養(yǎng)基與GDNF處理組差別不大；條件培養(yǎng)基組Bcl-2的表達(dá)高于GDNF處理組，GDNF處理組高于對照組；條件培養(yǎng)基組PCNA的表達(dá)高于高于GDNF處理組，GDNF處理組高于對照組。說明在增殖的第一個高峰，條件培養(yǎng)基組培養(yǎng)狀態(tài)好于GDNF處理組

6、與對照組，GDNF處理組好于對照組。
　　 6.在培養(yǎng)的第五天，條件培養(yǎng)基組、GDNF處理組、對照組Bax的表達(dá)差異不大，保持在較高的水平；條件培養(yǎng)基組Bcl-2的表達(dá)高于GDNF處理組，GDNF處理組高于對照組；條件培養(yǎng)基組的PCNA的表達(dá)高于GDNF處理組和對照組，GDNF處理組和對照組差異不大。說明在培養(yǎng)的第五天，三組細(xì)胞均處于高凋亡率時期，細(xì)胞數(shù)量處于最低，但條件培養(yǎng)基組增殖情況好于GDNF處理組與對照組。
　　

7、 7.在培養(yǎng)的第七天，條件培養(yǎng)基組Bax的表達(dá)低于GDNF處理組與對照組，條件培養(yǎng)基組與GDNF處理組表達(dá)差異不大；條件培養(yǎng)基組Bcl-2的表達(dá)高于GDNF處理組和對照組，GDNF處理組與對照組差異不大；條件培養(yǎng)基組PCNA的表達(dá)高于GDNF處理組與對照組，GDNF處理組與對照組差異不大。說明在第二個增殖高峰，條件培養(yǎng)基組仍保持較高的增殖水平，且凋亡率不高；而GDNF處理組和對照組增增水平相近，且處于較高的凋亡水平。
　　 以上