乳腺上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基對人脂肪干細(xì)胞增殖和上皮分化的影響.pdf

1、第一部分人乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)和條件培養(yǎng)基的制備
　　目的：分離和培養(yǎng)人肥大乳房乳腺上皮細(xì)胞,制備分別來自人肥大乳房乳腺上皮細(xì)胞和正常乳腺上皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
　　方法：采用膠原酶消化法從人肥大乳房的乳腺組織中分離乳腺上皮細(xì)胞,并傳代培養(yǎng)至第3代;復(fù)蘇凍存的人正常乳腺上皮細(xì)胞株(HBL-100),并進(jìn)行培養(yǎng)。MTT法繪制兩種細(xì)胞的生長曲線,比較其增殖能力的差別。收集兩種乳腺上皮細(xì)胞的上清液,制備條件培養(yǎng)基。對條件培養(yǎng)基進(jìn)

2、行質(zhì)量檢測。
　　結(jié)果：分離和培養(yǎng)的人肥大乳房乳腺上皮細(xì)胞,以及復(fù)蘇的正常乳腺上皮細(xì)胞株(HBL-100)生長狀況良好,為典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。MTT法顯示兩種細(xì)胞的光密度值(OD值)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。制備的條件培養(yǎng)基外觀清亮、無菌、PH值7.35±0.06、葡萄糖濃度為100㎎/dl。
　　結(jié)論：同樣培養(yǎng)條件下,HBL-100較肥大乳房乳腺上皮細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)。成功制備來自于乳腺上皮細(xì)胞的符合細(xì)胞培養(yǎng)基本要求

3、的條件培養(yǎng)基。
　　第二部分不同條件培養(yǎng)基對人脂肪干細(xì)胞增殖能力的影響
　　目的：觀察兩種條件培養(yǎng)基對人脂肪干細(xì)胞生長和增殖能力的影響,為下一步誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞定向分化篩選合適的條件培養(yǎng)基。
　　方法：體外分離和培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物CD13、CD29、CD44、CD45、CD90和CD105的表達(dá),并體外誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化。用不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞,MTT法繪制細(xì)胞

4、的生長曲線,比較不同條件培養(yǎng)基對脂肪干細(xì)胞增殖能力的差別。
　　結(jié)果：體外分離和培養(yǎng)的人脂肪干細(xì)胞生長狀況良好,呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示CD13、CD29、CD44、CD90和CD105陽性表達(dá),而不表達(dá)CD45,經(jīng)成脂和成軟骨定向誘導(dǎo),細(xì)胞分別出現(xiàn)脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的表型特征。脂肪干細(xì)胞經(jīng)人肥大乳房乳腺上皮細(xì)胞和HBL-100的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后,分別出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目減少和增殖旺盛的現(xiàn)象。
　　結(jié)論：來自于

5、人肥大乳房乳腺上皮的條件培養(yǎng)基不能促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的正常生長和增殖。而來自于人正常乳腺上皮細(xì)胞株(HBL-100)的條件培養(yǎng)基可促進(jìn)細(xì)胞的正常增殖,適合于用作脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)液。
　　第三部分條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞向乳腺上皮細(xì)胞分化的實驗研究
　　目的：探討條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞(ADSCs)向乳腺上皮細(xì)胞定向分化的可行性。
　　方法：實驗組和對照組分別采用條件培養(yǎng)基和DMEM/F12﹢10％FBS培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞

6、,培養(yǎng)16天,Westernblot檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物卵透明帶蛋白1(zonaoccludensprotein1,ZO1)和細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin18,CK18)的表達(dá)。誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞在體外進(jìn)行三維培養(yǎng)16天,免疫熒光細(xì)胞染色法檢測細(xì)胞IV型膠原的表達(dá),QRT-PCR檢測細(xì)胞α-酪蛋白(α-casein)mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：培養(yǎng)后14天,實驗組誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀拥膱A形,Westernblot檢測上