支持細(xì)胞通過外泌體途徑維持精原干細(xì)胞存活的研究.pdf

1、外泌體，一類直徑在50-150nm具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，存在于生物的各種體液中。外泌體可以通過負(fù)載蛋白質(zhì)、多肽、mRNA、長鏈非編碼RNA、miRNA、環(huán)狀RNA以及tsRNA調(diào)節(jié)不同細(xì)胞的生物活性。目前，許多研究表明外泌體在腫瘤的形成、遷移和代謝方面發(fā)揮著重要作用，同時還與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。
　　在精子發(fā)生的過程中，精原干細(xì)胞除了形成一個走向分化命運(yùn)的精原細(xì)胞外，還會形成一個與自身相同仍舊擁有干性的細(xì)胞。在睪丸曲細(xì)精

2、管內(nèi)的“niche”微環(huán)境中，支持細(xì)胞分泌的各類因子對于精原干細(xì)胞的自我維持與更新發(fā)揮著重要的作用。附睪和精漿中的細(xì)胞外囊泡參與了精子發(fā)生的過程中，然而，在曲細(xì)精管內(nèi)支持細(xì)胞來源的胞外囊泡對精原干細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用所知甚少。
　　本研究對支持細(xì)胞分泌的胞外囊泡進(jìn)行了鑒定，并且探究了其對精原干細(xì)胞的影響，主要結(jié)果為:
　　(1)收集不同發(fā)育階段小鼠的睪丸，通過免疫組織化學(xué)的方法，在曲細(xì)精管內(nèi)對外泌體標(biāo)志性蛋白質(zhì)CD63進(jìn)行了定位。

3、發(fā)現(xiàn)在小鼠不同發(fā)育階段，CD63主要定位在支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，并且呈顆粒狀分布。同時，CD63在小鼠出生后前7d有很高的表達(dá)量，這表明含有CD63的陽性囊泡在精子發(fā)生的過程中發(fā)揮著重要作用。
　　(2)通過梯度離心和超速離心的方法，首次分離純化出原代支持細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡。在電鏡下可以觀察到囊泡具有雙層膜結(jié)構(gòu)，并且通過納米顆粒跟蹤儀測量出囊泡的大小主要在76nm左右。利用蛋白質(zhì)免疫印跡發(fā)現(xiàn)分離出的囊泡含有外泌體的特異性蛋白質(zhì)CD6

4、3。因此，從形態(tài)特征、粒徑大小以及標(biāo)志性蛋白質(zhì)這三個方面鑒定出這類囊泡主要是外泌體。
　　(3)用DiI對分離出的外泌體進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)DiI-外泌體可以附著在C18-4細(xì)胞以及原代精原干細(xì)胞的表面，呈現(xiàn)顆粒狀不均勻分布。
　　(4)在無血清的培養(yǎng)條件下添加100ng/μL外泌體培養(yǎng)24h，同時未添加外泌體的細(xì)胞作為對照組。發(fā)現(xiàn)加入外泌體后，C18-4細(xì)胞和原代精原干細(xì)胞的狀態(tài)良好，細(xì)胞飽滿，表面光滑，而對照組的細(xì)胞表面出現(xiàn)大