巴馬小型豬精原干細胞相關(guān)問題的研究.pdf

1、精原干細胞(spermatogonial stem cells，SSCs)位于動物睪丸的精細小管，是動物體內(nèi)唯一一種定向分化為精子的成體干細胞。分離、純化和體外培養(yǎng)SSC，可以為SSC的體外研究提供必要的實驗材料。定向誘導(dǎo)SSC分化成精子可以研究精子發(fā)生的機理，同時也可以為無精癥患者提供生育自己后代的機會。通過轉(zhuǎn)染SSC，誘導(dǎo)其分化成攜帶有外源基因的精子細胞或精子，利用這些攜帶外源基因的精子細胞或精子受精就可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。這種轉(zhuǎn)基因

2、胚胎產(chǎn)生的過程和自然條件下精子、卵子結(jié)合產(chǎn)生胚胎的過程一樣，不涉及體細胞重編程過程，所以利用SSC生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的效率要遠遠高于體細胞核移植法。本論文的研究內(nèi)容是巴馬小型豬SSC的分離、純化、鑒定、體外長期培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)基因的研究，其結(jié)果如下:
　　1.巴馬小型豬睪丸的形態(tài)學(xué)觀察和精原干細胞的鑒定
　　本研究首先對巴馬小型豬睪丸組織進行了形態(tài)學(xué)觀察和SSC的鑒定。組織學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)1月齡仔豬睪丸的SSC還沒有分化，而2月齡仔豬睪

3、丸中已經(jīng)有精子產(chǎn)生，所以1月齡仔豬睪丸適合于SSC的分離。已有的研究證明豬的精原干細胞表達UCHL1，并且可以和植物凝集素DBA結(jié)合，SSC的免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴馬小型豬SSC表達UCHL1和CDH1，可以和植物凝集素DBA結(jié)合，但不表達C-KIT，從而證明抗體UCHL1、CDH1以及植物凝集素DBA是巴馬小型豬SSC的生物標志物，可以用來鑒定體外培養(yǎng)的SSC。所以，本研究選用抗體UCHL1、CDH1和植物凝集素DBA用來鑒定體外

4、培養(yǎng)的精原干細胞。
　　2.精原干細胞的分離和體外培養(yǎng)
　　本實驗采用組合酶消化法將巴馬小型豬睪丸組織消化成分散的細胞，培養(yǎng)60 h，擴增SSC的數(shù)量，然后通過差異貼壁法分選出SSC，將分離出的細胞接種到STO飼養(yǎng)層上進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的前兩代，由于細胞的數(shù)量少，不能形成細胞簇，從第三代開始，很多細胞聚集在一起形成細胞簇，這些細胞簇的細胞結(jié)合不夠緊密，邊緣不清晰。目前為止，SSC在體外已經(jīng)傳代達30代，維持了細胞簇形成的特性。

5、
　　3.體外培養(yǎng)的精原干細胞的鑒定
　　免疫熒光染色結(jié)果顯示這些細胞簇表達SSC生物標志物UCHL1和CDH1，并且可以和植物凝集素DBA結(jié)合，細胞簇中部分細胞表達OCT4; RT-PCR檢測結(jié)果證明這些細胞簇表達基因nanog、sox2、vasa、uchll和thyl，鑒定結(jié)果證明這些細胞簇是由SSC組成。在體外培養(yǎng)的SSC中存在著大小不同的UCHL1陽性細胞，說明SSC大小本身存在著差異。SSC超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)

6、的SSC的線粒體脊比組織內(nèi)SSC線粒體脊豐富。DNA含量分析顯示部分巴馬小型豬SSC在體外長期培養(yǎng)后經(jīng)流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)單倍體峰。
　　4.精原干細胞轉(zhuǎn)基因方法的初步探索
　　本研究嘗試將外源基因?qū)氲絊SC中。首先嘗試利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將攜帶有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SSC中，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)染途徑效率低，不能得到陽性細胞簇。之后，我們嘗試利用慢病毒感染法將外源基因?qū)氲絊SC內(nèi)，實驗發(fā)現(xiàn)在MOI(multiplicit

7、y of infection)值為50時，可以有效的將GFP基因?qū)氲絊SC內(nèi)，可以得到陽性細胞簇。
　　綜上所述，本研究分離純化了巴馬小型豬SSC，這些SSC可在體外培養(yǎng)到30代以上，為精原干細胞的基因操作和精子分化機理的研究提供了充足的實驗材料。本研究還發(fā)現(xiàn)巴馬小型豬SSC在體外長期培養(yǎng)后經(jīng)流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)了單倍體峰，利用慢病毒感染法可以有效的將GFP基因?qū)氲絊SC內(nèi)。這些研究結(jié)果為轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬的生產(chǎn)建立了實驗平臺，也