microRNAs調(diào)控Satb2介導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用研究.pdf

1、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)作為成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，對(duì)于骨的形成和重建具有重要的意義，通過基因治療的方法增加BMSCs的成骨潛能成為一個(gè)新的研究領(lǐng)域。Satb2是一種特殊富含AT序列結(jié)合蛋白家族的核基質(zhì)蛋白，在BMSCs的分化和頜面部骨的修復(fù)重建過程中起重要的作用。作為一個(gè)在成骨分化和骨骼塑型中起重要作用的基因，Satb2對(duì)BMSCs定向、分化和增殖等行為的調(diào)控機(jī)制有待研究。
　　本研究擬使用慢病毒轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定表達(dá)Satb2的BM

2、SCs細(xì)胞株，通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)觀察Satb2對(duì)成骨分化的促進(jìn)作用，通過miRNA表達(dá)譜分析觀察miRNAs在Satb2介導(dǎo)的BMSCs成骨分化過程中的作用，對(duì)Satb2促進(jìn)成骨分化的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究，為基因治療和干細(xì)胞技術(shù)在骨再生領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供更直接的科學(xué)線索。
　　材料和方法:
　　第一部分
　　使用PCR克隆小鼠Satb2基因，構(gòu)建pTA2-Satb2質(zhì)粒。將質(zhì)粒pTA2-Satb2與慢病毒載體重

3、組形成慢病毒載體LV-Satb2，建立穩(wěn)定表達(dá)Satb2的BMSCs細(xì)胞株。分別于成骨誘導(dǎo)7d和14d進(jìn)行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色。使用蛋白印跡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測成骨因子Runx2、 Sp7、At f4和Bsp的表達(dá)。
　　將β-磷酸三鈣支架和BMSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中聯(lián)合培養(yǎng)14d后，將共培養(yǎng)物植入小鼠股二頭肌內(nèi)側(cè)。4周后將植入物取出進(jìn)行組織學(xué)觀察和實(shí)時(shí)定量PCR檢測成骨因子表達(dá)。
　　第二部分
　　使用Aff

4、ymetrix(R) GeneChip miRNA芯片檢測Satb2過表達(dá)的BMSCs在成骨誘導(dǎo)7d時(shí)的miRNA表達(dá)情況，將差異變化≥1.5倍作為顯著差異，并通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。利用生物信息學(xué)工具從Sanger數(shù)據(jù)庫中篩選出差異表達(dá)的miRNA并對(duì)靶基因進(jìn)行預(yù)測，使用GO和KEGG通路分析的方法探討基因和miRNA的相互作用。
　　選擇差異表達(dá)的miR-27a進(jìn)行功能性分析。首先通過慢病毒載體建立miR-27a過表達(dá)的B

5、MSCs，為了驗(yàn)證miR-27a對(duì)成骨分化的作用，對(duì)轉(zhuǎn)染后的BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，分別于第7d和第14d進(jìn)行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色檢測miR-27a對(duì)成骨分化的影響。使用蛋白印跡檢測miR-27a的靶基因（BMP2、BMPR1a和Smad9）的表達(dá)。
　　第三部分
　　為了進(jìn)一步探討Satb介導(dǎo)的成骨分化過程中miRNA和靶基因的調(diào)控作用，使用蛋白印跡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測Satb2過表達(dá)的BMSCs在成骨分化過程中

6、Sp7和miR-27a的表達(dá)情況。使用蛋白印跡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR-27a過表達(dá)的BMSCs中Sp7的表達(dá)。使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測Satb2過表達(dá)的BMSCs成骨分化中相關(guān)成骨因子的表達(dá)情況。
　　使用PCR擴(kuò)增含miR-27a靶位點(diǎn)的Sp7編碼區(qū)，構(gòu)建靶基因psiCHECK-2-Sp7并測序鑒定。以構(gòu)建的重組載體psiCHECK-2-Sp7為模板，利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行定點(diǎn)突變，并經(jīng)酶切測序鑒定。分別與miR-27a表達(dá)載

7、體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過熒光素酶活性反應(yīng)驗(yàn)證Sp7是否為miR-27a的靶基因。
　　結(jié)果:
　　第一部分
　　蛋白印跡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)Satb2過表達(dá)的BMSCs中Satb2均高表達(dá)，Runx2、 Sp7、 Atf4和Bsp等成骨相關(guān)基因的表達(dá)同樣顯著增加。成骨誘導(dǎo)分化7d和14d時(shí)，Satb2過表達(dá)組中堿性磷酸酶和茜素紅染色均高于對(duì)照組。體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Satb2過表達(dá)的BMSCs能夠顯著促進(jìn)異位新骨的形

8、成。
　　第二部分
　　miRNA表達(dá)譜檢測發(fā)現(xiàn)28個(gè)miRNAs差異表達(dá)，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證4個(gè)miRNAs(miR-27a、 miR-125a-5p、 miR-146b和miR-466f-3p)下調(diào)和3個(gè)miRNAs(miR-17、miR-20a和miR-210)上調(diào)。GO分析顯示這些miRNA的靶基因的主要功能為調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞分化、骨形成和骨骼發(fā)育以及BMP信號(hào)通路和TGF-β受體信號(hào)通路。KEGG通路分析顯示TG

9、F-β、 MAPK、 Wnt、 hedgehog和VEGF通路參與了Satb2介導(dǎo)的BMSCs成骨分化。
　　在miR-27a過表達(dá)的BMSCs細(xì)胞中，蛋白印跡顯示BMP2、BMPR1A和Smad9在miR-27a轉(zhuǎn)染后表達(dá)顯著下降，提示BMP2、BMPR1A和Smad9可能是miR-27a的靶基因。miR-27a過表達(dá)的BMSCs在成骨分化中，堿性磷酸酶和茜素紅染色較對(duì)照組均顯著降低。
　　第三部分
　　在Satb2

10、介導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中， Sp7表達(dá)的上調(diào)趨勢與miR-27a的下調(diào)趨勢呈現(xiàn)時(shí)間依賴的負(fù)相關(guān)。在miR-27a過表達(dá)的BMSCs中， Sp7的蛋白水平和基因水平較對(duì)照組明顯下降。
　　miR-27a和Sp7共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對(duì)活性較空白對(duì)照組明顯降低，而miR-27a和Sp7變異組則無明顯變化，提示Sp7可能是miR-27a直接作用的靶基因。
　　結(jié)論:
　　1.通過慢病毒轉(zhuǎn)染建立了穩(wěn)定表達(dá)Satb2的BMSC

11、s細(xì)胞株，體外細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Satb2促進(jìn)BMSCs的成骨分化，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明Satb2過表達(dá)的BMSCs能夠有效地促進(jìn)異位新骨形成。
　　2.通過miRNA基因芯片和生物信息學(xué)分析的方法，發(fā)現(xiàn)一系列差異表達(dá)的miRNA通過其靶基因正向或負(fù)向調(diào)控TGF-β/BMP信號(hào)通路，在Satb2介導(dǎo)的BMSCs成骨分化的早期階段發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。
　　3.在Satb2介導(dǎo)的BMSCs成骨分化中，Sp7作為miR-27a的靶基因，與S