合成成骨生長肽對大鼠及人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的促成骨作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、成骨生長肽(OGP)是一種在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在的由14個氨基酸組成的多肽。其序列已測定。我們在體外人工合成了成骨生長肽，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它在體內(nèi)和體外具有明顯的促成骨作用。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是存在于骨髓組織中的成體干細(xì)胞，具有多向分化能力。本實(shí)驗(yàn)前兩部分研究了合成成骨生長肽(sOGP)對體外培養(yǎng)的大鼠及人BMSCs增殖和分化的影響，以驗(yàn)證sOGP的促成骨作用是否是通過其對BMSCs的作用實(shí)現(xiàn)的。既往的研究顯示OGP受體屬于一種G蛋白

2、耦聯(lián)受體(GPCRs)，而MAPK信號傳導(dǎo)通路是GPCRs重要的下游信號通路之一，實(shí)驗(yàn)第三部分即研究了MAPK家族中三個主要成員：ERK、JNK、p38激酶在sOGP作用后的表達(dá)變化，以研究sOGP作用的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制。 方法：實(shí)驗(yàn)第一部分研究了不同濃度的sOGP對大鼠BMSCs增殖和向成骨方向分化的影響。采用貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs。采用倒置顯微鏡和電子顯微鏡觀察sOGP作用后細(xì)胞形態(tài)的變化。采用MTT法測量各組細(xì)胞增殖率

3、并繪制生長曲線，以研究sOGP對細(xì)胞增殖的作用。采用RT-PCR、化學(xué)測量、組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)染色等方法，在mRNA和蛋白兩個水平檢測堿性磷酸酶(ALP)、I型膠原(COLI)、骨鈣素(OC)等成骨標(biāo)志物的表達(dá)，并與經(jīng)典的成骨誘導(dǎo)劑地塞米松相對比，進(jìn)行定量分析。 實(shí)驗(yàn)第二部分進(jìn)一步研究了sOGP對人BMSCs增殖和向成骨方向分化的影響。采用密度梯度離心和貼壁分離法相結(jié)合獲得了比較均一的人BMSCs。對細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞增殖率

4、和成骨標(biāo)志物表達(dá)的檢測方法與第一部分相同，并比較了sOGP對大鼠和人BMSCs作用的異同。 實(shí)驗(yàn)第三部分研究了sOGP作用后，人BMSCs細(xì)胞內(nèi)MAPK家族中三個主要成員的表達(dá)變化。采用Western-blot方法檢測了sOGP作用后第1、2、4、6、8、10、12、14、16天時，ERK、JNK、p38激酶及其磷酸化激活形式的水平變化。采用ERKl／2通路特異性的阻斷劑U0126預(yù)處理細(xì)胞后，觀察對sOGP促成骨作用的影響。

5、 結(jié)果：加入sOGP后，大鼠BMSCs形態(tài)發(fā)生明顯變化，隨著培養(yǎng)時間延長，可見有致密的細(xì)胞結(jié)節(jié)和骨小梁樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，電鏡觀察顯示細(xì)胞處于功能活躍狀態(tài)。sOGP對大鼠BMSCs增殖的影響隨濃度不同而顯示出輕度抑制和輕度促進(jìn)的作用，其中在10一‰ol／L時，抑制作用最明顯。而RT-PCR發(fā)現(xiàn)sOGP作用后細(xì)胞內(nèi)三種成骨標(biāo)志物的mRNA都有表達(dá)，而ALP測量和細(xì)胞染色結(jié)果則顯示了ALP和COLI在蛋白水平的表達(dá)以及鈣結(jié)節(jié)的存在，結(jié)果定量分

6、析顯示，在sOGP濃度為10一~mol／L時成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平最高，顯示出最強(qiáng)的促成骨能力，并強(qiáng)于地塞米松對照組。 sOGP對人BMSCs的作用與大鼠不盡相同，雖然也有形態(tài)上的明顯變化并形成細(xì)胞結(jié)節(jié)，但沒有骨小梁樣結(jié)果出現(xiàn)，電鏡觀察也提示細(xì)胞處于功能活躍狀態(tài)。sOGP對人BMSCs增殖的作用也受濃度影響，基本上是輕度促進(jìn)作用，其中在10一Umol／L時，促進(jìn)作用最明顯。RT-PCR、細(xì)胞染色和ALP測量也證實(shí)了成骨標(biāo)志物的表達(dá)

7、，定量分析也以10—9mol／L濃度組促成骨能力最強(qiáng)，并強(qiáng)于地塞米松對照組。 sOGP作用后，Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)ERKl／2的表達(dá)在各時間點(diǎn)沒有明顯變化，但其磷酸化激活形式在第2天左右開始升高，第4天達(dá)到峰值(比基線水平高出約5—6倍)，6天后逐漸降至基線水平，而這一時期正是細(xì)胞向成骨方向轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時期。p38的總量也沒有明顯變化，而磷酸化的p38約在第8天左右開始升高，10天左右達(dá)到峰值(比基線水平高約3

8、倍)，12后降至基線水平。JNK的表達(dá)則沒有明顯變化。采用U0126預(yù)處理細(xì)胞，特異性阻斷ERKl／2的作用后發(fā)現(xiàn)sOGP促進(jìn)細(xì)胞ALP表達(dá)的作用幾乎完全被阻斷，而脂肪染色則顯示細(xì)胞發(fā)生了向脂肪方向的轉(zhuǎn)化。 結(jié)論：1．合成成骨生長肽(sOGP)對大鼠和人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)均有明顯的促成骨作用。這種作用的強(qiáng)弱與sOGP的濃度密切相關(guān)，在10一9mol／L濃度下，其促成骨作用最強(qiáng)。 2·合成成骨生長肽(sOGP)對