NGF促進雪旺細胞增殖及其NF-KB表達上調的研究.pdf

1、目的：目前,相關研究發(fā)現(xiàn)NGF對雪旺細胞的增殖具有促進作用。同時,在雪旺細胞增殖的過程中發(fā)現(xiàn)有NF-KB的表達?，F(xiàn)已明確NF-KB的表達對細胞具有抗凋亡、促增殖的效果。本實驗據(jù)此就NGF促進SCs的增殖及其與NF-KB的表達上調是否存在某種關系進行了研究.旨在為進一步明確雪旺細胞增殖的機制提供相關數(shù)據(jù)。
　　方法：選擇健康家兔十只,給予5％戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉,無菌條件下取出坐骨神經,分離培養(yǎng)出雪旺細胞,并進行S-10

2、0免疫細胞化學鑒定,以鑒定細胞純度,將細胞密度調整至1×105/ml后,接種到預涂有鼠尾膠的三個培養(yǎng)皿,分別計為實驗組(加入40ng/ml的NGF);阻斷組(加入40ng/ml的NGF和anti-NGFR);對照組(加入等量PBS)。置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天,熒光顯微鏡下觀察S-100熒光標記陽性細胞并計數(shù),提取RNA及蛋白進行相關檢測,每組應進行三次重復實驗。然后進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：接種后的第24h開始,

3、可以倒置顯微鏡下觀察到貼壁生長的具有明顯形態(tài)的雪旺細胞,鏡下觀察所有分組的細胞都包含兩類,雪旺細胞胞核為長形或圓形;胞體為立體感強、非常飽滿的梭形體,兩端有細長的突起,胞體周圍長有亮帶,即生長暈,細胞數(shù)量占絕大多數(shù)。另一種細胞即成纖維細胞,胞核很淺,具2~3個核仁,胞體扁平、大且不規(guī)則,常常出現(xiàn)多而短的突起,數(shù)量較少。所有分組的雪旺細胞均呈“端端相對,極極相對”等旋渦排列或網狀排列,逐漸形成片狀,有如“地毯”。S-100免疫組化檢測鑒定

4、,對胞漿為棕褐色的陽性細胞進行計數(shù),結果為:本研究體外培養(yǎng)的雪旺細胞純度達到了91%。OD值結果顯示:實驗組中,雪旺細胞24~72h增殖速率明顯加強,72h后增殖依然強勁,至第5d達到峰值,最后漸漸緩慢下降;期間與對照組在每一時間節(jié)點均出現(xiàn)顯著差異。自CLSM上進行圖像采集顯示:阻斷組和實驗組雪旺細胞的NF-KB綠色熒光同樣多出現(xiàn)于胞漿區(qū);實驗組強度較正常組顯著提高,而阻斷組與對照組無明顯差別。經LeiCaConfoeal圖像分析軟件分

5、析,結果顯示:阻斷組與實驗組均出現(xiàn)顯著差異(p<0.01),而對照組與阻斷組組無顯著差異(p>0.05)。對照組、阻斷組、實驗組雪旺細胞中NF-KBmRNA進行實時熒光定量PCR檢測后,實驗組較對照組、阻斷組出現(xiàn)顯著增高,而阻斷組和對照組相比,無顯著差異。
　　結論：1.采用組織貼塊法、差速貼壁法與低濃度胰蛋白酶消化法、G-418相結合的純化形式,可以建立良好的家兔坐骨神經SCs原代培養(yǎng)模型。
　　2.添加40ng/L的外源

6、性NGF可以顯著提高SCs的增殖速率,同時NF-KB表達明顯上調。添加NGF+anti-NGFR組的SCs細胞增殖速率和NF-KB的表達水平都與對照組無明顯區(qū)別.由此可以說明NGF是通過與P75結合來促進雪旺細胞增殖和提高NF-KB表達水平的。
　　3.NF-KB表達在SCs增殖過程中表達上調,且增殖最快的實驗組中表達上調的最高,且大量實驗研究表明NF-KB的表達可以抑制細胞的凋亡,促進細胞的增殖。所以推測NF-KB的高表達對雪旺