HBV通過上調(diào)miR-181a表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖.pdf

1、目的:
　　研究HBV促進(jìn)miR-181a表達(dá)的機(jī)制，以及miR-181a上調(diào)對肝癌發(fā)生發(fā)展的影響。
　　方法:
　　1.運(yùn)用qRT-PCR比較HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞及表達(dá)HBV腺病毒感染后的HepG2細(xì)胞（Ad-HBV-HepG2）和表達(dá)GFP腺病毒感染后的HepG2細(xì)胞(Ad-GFP-HepG2)中miR-181a的表達(dá)差異。
　　2.構(gòu)建miR-181a啟動子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染入Hep

2、G2和HepG2.2.15細(xì)胞，Ad-HBV-HepG2和Ad-GFP-HepG2細(xì)胞。用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測miR-181a啟動子活性，以了解HBV對miR-181a啟動子活性的影響。
　　3.將構(gòu)建的miR-181a過表達(dá)質(zhì)粒和miR-181a inhibitor分別轉(zhuǎn)染入SMMC7721細(xì)胞中，運(yùn)用MTS檢測miR-181a過表達(dá)和干擾后肝癌細(xì)胞增殖的影響。同時用MTS比較miR-181a過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系p-miR-

3、181a和其對照p-control細(xì)胞增殖情況。
　　4.通過miRNAs靶基因預(yù)測軟件，如TargetScan和MiRanda初步篩選一些與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因。構(gòu)建靶基因3'末端熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)分析miR-181a對這些靶基因的影響。
　　5.運(yùn)用qRT-PCR和Western Blot檢測SMMC7721細(xì)胞中過表達(dá)和干擾miR-181a后E2F5的表達(dá)變化。
　　6.運(yùn)用MTS和克

4、隆形成實(shí)驗(yàn)檢測在SMMC7721細(xì)胞中干擾E2F5后細(xì)胞的增殖情況。
　　7.運(yùn)用qRT-PCR和Western Blot檢測HBV對E2F5表達(dá)的影響，以及MTS驗(yàn)證HBV對肝癌細(xì)胞增殖的影響。并且通過MTS和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染后的HepG2.2.15細(xì)胞的生長情況。
　　8.通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-181a和E2F5對肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　1

5、.HBV通過增強(qiáng)miR-181a啟動子活性上調(diào)miR-181a的表達(dá)。
　　2.miR-181a能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。
　　3.E2F5是miR-181a的靶基因。
　　4.E2F5參與miR-181a所誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖。
　　5.HBV下調(diào)E2F5的表達(dá)。
　　6.miR-181a促進(jìn)裸鼠皮下肝癌細(xì)胞成瘤。
　　結(jié)論:
　　HBV在肝癌細(xì)胞中上調(diào)miR-181a的表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的形成可能是通