Kruppel樣因子8通過上調(diào)FLT1促進769-P腎癌細胞株體外增殖.pdf

1、目的:在腎透明細胞癌細胞系786-O細胞株中瞬時敲低Kruppel樣因子8(Kruppellike factor8，KLF8)的表達能夠抑制786-O細胞系的增值，但KLF8在腎癌中的作用機制并不清楚，既往的研究表明，在腎癌中VHL突變導致的VEGF/VEGFR、PDGFβ/PAGFRβ、TGF/EGFR過度激活，在腎癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，本研究旨在探討過表達KL8基因?qū)δI透細胞癌細胞系769-P的增值能力的影響，以及該作用是否與上

2、述經(jīng)典通路有關，其作用靶點是什么。
　　方法:應用慢病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建重組KLF8質(zhì)粒，與空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293V細胞進行病毒包裝，再分別感染769-P細胞株，利用實時熒光定量PCR技術(Real TimePCR)及Western blot技術檢測769-P細胞KLF8的表達情況。根據(jù)769-P細胞感染重組KLF8慢病毒或空載體將其分為兩組進行功能實驗，用平板克隆實驗及MTS方法檢測769-P細胞增殖能力的變化，應用流式細胞學技術

3、檢測細胞周期變化。應用Western blot技術檢測潛在靶基因在過表達KLF8組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組中的表達情況。應用siRNA(small interference RNA)技術敲低FLT1后根據(jù)FLT1蛋白表達量篩選出敲低效果最明顯的siRNA。分別在轉(zhuǎn)染pLV-EGFP(2A)Puro-KLF8質(zhì)粒和pLV-EGFP(2A) Puro空載體質(zhì)粒的769-P細胞中轉(zhuǎn)染siFLT1，再應用平板克隆實驗，MTS實驗檢測769-P細胞株增殖能

4、力的變化。
　　結(jié)果:①成功篩選出高表達KLF8基因的769-P細胞株，轉(zhuǎn)染pLV-EGFP(2A)Puro-KLF8組的KLF8蛋白表達較對照組顯著上調(diào)。②平板克隆實驗:轉(zhuǎn)染pLV-EGFP(2A)Puro-KLF8組較空載體組克隆數(shù)明顯增多(P＜0.05)。③MTS實驗，在48h、72h、96h的檢測中，實驗組在490nm吸光值顯著升高(P＜0.05)。④流式細胞學檢測細胞周期，轉(zhuǎn)染pLV-EGFP(2A) Puro-KLF8

5、組G0/G1細胞比例明顯減少S期細胞比例增加。⑤Western blot檢測發(fā)現(xiàn)FLT1在實驗組中表達顯著上升。⑥應用siFLT1敲低FLT1后，769-P細胞株的增值能力明顯下降，平板克隆實驗:769P-KLF8+control克隆數(shù)最多，769P-KLF8+siFLT1與769P-EMPTY+control組次之,769-P-EMPTY+siFLT1克隆數(shù)最少;MTS:769P-KLF8+control組于72h，96h時間點在49