Id1通過上調(diào)Wnt2表達(dá)調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞周期的研究.pdf

1、目的：
　　動脈粥樣硬化的始動因素之一是血管內(nèi)皮層結(jié)構(gòu)損傷和（或）功能障礙。所以維持血管內(nèi)皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)及功能的完整性是預(yù)防和治療動脈粥樣硬化的重要環(huán)節(jié)。骨髓中存在一種血管內(nèi)皮前體細(xì)胞～內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，可動員被釋放入外周血后歸巢到血管內(nèi)皮損傷部位參與再內(nèi)皮化，發(fā)揮其血管損傷修復(fù)的功能。但是，EPCs在外周血中數(shù)量極其有限，有限的數(shù)量是制約EPCs發(fā)揮內(nèi)皮損傷修復(fù)功能的

2、重要因素。因此，增加EPCs外周血含量成為目前研究熱點。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)DNA結(jié)合抑制因子-1(Inhibitor of DNA binding1，Id1)在促進EPCs增殖方面起著重要作用。但是，Id1促進EPCs增殖的具體分子機制尚不完全清楚。
　　Id1是螺旋環(huán)螺旋(helix-loop-helix，HLH)家族成員之一，參與細(xì)胞增殖、遷移、分化等多種細(xì)胞活動進程。在腫瘤細(xì)胞中Id1可通過上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclin

3、 D1的表達(dá)促進細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化，進一步促進腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期演進。細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，Id1是否調(diào)控EPCs細(xì)胞周期尚無文獻(xiàn)報道。另外，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Id1基因敲除小鼠的肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞中Wnt2顯著減少，且肝血管再生功能缺失，外源性的Wnt2能夠恢復(fù)其肝血管再生的功能。Wnt2參與血管生成，并在干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中起重要作用。而細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclin D1正是Wnt/β-Catenin信號通路的經(jīng)典下游靶點。

4、因此，提出假設(shè)Id1能通過Wnt2作用于EPCs細(xì)胞周期調(diào)控。
　　本研究通過探討Id1在EPCs細(xì)胞周期調(diào)控中的作用及可能機制，為研究Id1調(diào)控EPCs增殖的分子機制提供了新思路。
　　方法：
　　1.小鼠骨髓源性EPCs分離培養(yǎng)與鑒定
　　1.1小鼠骨髓源性EPCs分離培養(yǎng)
　　我們利用密度梯度離心法，從小鼠脛骨和股骨中提取骨髓源性單個核細(xì)胞，并接種在明膠包被的培養(yǎng)瓶中，給予含20％胎牛血清的DMEM-

5、F12培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時后，棄除未貼壁細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4-7天。
　　1.2 EPCs鑒定
　　1.2.1倒置顯微鏡下觀察EPCs形態(tài)學(xué)特點;
　　1.2.2給予Dil-Ac-LDL及FITC-UEA-1孵育，然后給予DAPI孵育后進行共聚焦熒光鏡檢測熒光雙染率;
　　1.2.3向待鑒定細(xì)胞中分別加入抗小鼠Sca-1和VEGFR2抗體，用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測細(xì)胞表型。
　　2.Id1對EPCs細(xì)

6、胞周期的影響
　　2.1過表達(dá)外源性Id1對EPCs細(xì)胞周期的影響
　　過表達(dá)Id1重組腺病毒轉(zhuǎn)染EPCs，用RT-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。用流式細(xì)胞儀檢測待檢細(xì)胞的細(xì)胞周期分布;用RT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞周期因子Cyclin D1的表達(dá)情況。
　　2.2干擾內(nèi)源性Id1表達(dá)對EPCs細(xì)胞周期的影響
　　siRNA轉(zhuǎn)染EPCs，用RT-PCR和Western blot檢

7、測干擾內(nèi)源性Id1表達(dá)的效率。用流式細(xì)胞儀檢測待檢細(xì)胞的細(xì)胞周期分布;用RT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞周期因子Cyclin D1的表達(dá)情況。
　　3.Wnt2在Id1對EPCs細(xì)胞周期調(diào)控中的作用。
　　3.1過表達(dá)外源性Id1對Wnt2表達(dá)及β-Catenin細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的影響
　　提取過表達(dá)Id1重組腺病毒轉(zhuǎn)染后的EPCs中總RNA、總蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核蛋白，用RT-PCR和Western bl

8、ot檢測Wnt2表達(dá)情況及β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量的變化。
　　3.2干擾內(nèi)源性Id1表達(dá)對Wnt2表達(dá)及β-Catenin細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的影響
　　提取siRNA轉(zhuǎn)染后的EPCs中總RNA、總蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核蛋白，用RT-PCR和Western blot檢測Wnt2表達(dá)情況及β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量的變化。
　　3.3干擾Wnt2表達(dá)對Id1調(diào)控EPCs細(xì)胞周期的影響
　　用

9、siRNA轉(zhuǎn)染過表達(dá)Id1的EPCs，干擾Wnt2表達(dá)。用流式細(xì)胞儀檢測待檢細(xì)胞的細(xì)胞周期分布;用RT-PCR和Western blot檢測Id1、Wnt2及Cyclin D1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.Id1對EPCs細(xì)胞周期的影響
　　1.1小鼠骨髓源性EPCs分離培養(yǎng)與鑒定
　　骨髓單個核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)4-7天后可觀察到大量梭形、橢圓形、紡錘形細(xì)胞。Dil-Ac-LDL及FITC-UEA-1熒光雙染鑒定

10、，在激光共聚焦顯微鏡下可見，貼壁細(xì)胞中，細(xì)胞核攝取DAPI后呈藍(lán)色熒光，（91.4±2.0）％呈紅、綠熒光雙染，該雙染細(xì)胞即為EPCs。利用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測Sca-1和VEGFR-2在待測細(xì)胞表面表達(dá)情況，結(jié)果顯示:Sca-1陽性率為90.6％，VEGFR-2陽性率為94％。
　　1.2 Id1對EPCs細(xì)胞周期的影響
　　1.2.1過表達(dá)外源性Id1促進EPCs細(xì)胞周期的演進
　　流式細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染對

11、照組或Ad-vector轉(zhuǎn)染組比較，Ad-Id1轉(zhuǎn)染組的EPCs中處于G1期的細(xì)胞數(shù)顯著減少，處于S/G2M期的細(xì)胞數(shù)顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示Ad-Id1能促進EPCs細(xì)胞周期從G1期進入S/G2M期。同時，RT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞周期因子Cyclin D1的mRNA和蛋白含量，結(jié)果顯示Ad-Id1轉(zhuǎn)染組中Cyclin D1的mRNA和蛋白含量均顯著高于對照組。以上提示:Id1能促進EPCs

12、細(xì)胞周期從G1期進入S期。
　　1.2.2干擾內(nèi)源性Id1表達(dá)抑制EPCs細(xì)胞周期的演進
　　流式細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染對照組或si-con轉(zhuǎn)染組比較，si-Id1轉(zhuǎn)染組的EPCs中處于G1期的細(xì)胞數(shù)顯著增多，處于S/G2M期的細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示si-Id1能抑制EPCs細(xì)胞周期從G1期進入S/G2M期。同時，RT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞周期因子Cyclin D1的m

13、RNA和蛋白含量，結(jié)果顯示si-Id1轉(zhuǎn)染組中Cyclin D1的mRNA和蛋白含量均顯著低于對照組。以上提示:干擾Id1表達(dá)能抑制EPCs細(xì)胞周期從G1期進入S期。
　　2.Id1通過上調(diào)Wnt2表達(dá)調(diào)控EPCs細(xì)胞周期。
　　2.1過表達(dá)外源性Id1促進Wnt2表達(dá)及β-Catenin細(xì)胞核轉(zhuǎn)移
　　RT-PCR和Western blot檢測Wnt2的mRNA和蛋白含量，結(jié)果顯示Ad-Id1轉(zhuǎn)染組中Wnt2的mRN

14、A和蛋白含量均顯著高于對照組。Western blot檢測β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量，結(jié)果顯示Ad-Id1轉(zhuǎn)染組中β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量均顯著高于對照組。提示Ad-Id1可促進EPCs中Wnt2表達(dá)，及促進β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)中聚集并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　2.2干擾內(nèi)源性Id1表達(dá)抑制Wnt2表達(dá)及β-Catenin細(xì)胞核轉(zhuǎn)移
　　RT-PCR和Western blot檢測Wnt2的mR

15、NA和蛋白含量，結(jié)果顯示si-Id1轉(zhuǎn)染組中Wnt2的mRNA和蛋白含量均顯著低于對照組。Western blot檢測β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量，結(jié)果顯示si-Id1轉(zhuǎn)染組中β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中含量均顯著低于對照組。提示si-Id1可抑制EPCs中Wnt2表達(dá)，及抑制β-Catenin在細(xì)胞質(zhì)中聚集及向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　2.3干擾Wnt2表達(dá)拮抗Id1對EPCs細(xì)胞周期的調(diào)控作用
　　流式細(xì)胞

16、周期檢測發(fā)現(xiàn)，Ad-Id1/si-Wnt2組EPCs中G1期細(xì)胞比例較Ad-Id1/si-con組顯著升高，但低于Ad-vector/si-con組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同時，RT-PCR和Western blot檢測Cyclin D1的mRNA和蛋白含量，結(jié)果顯示Ad-Id1/si-Wnt2組中Cyclin D1的mRNA和蛋白含量均顯著低于Ad-Id1/si-con組，但高于Ad-vector/si-con組。提示W(wǎng)n