HMGB1對小鼠系膜細胞細胞周期及細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響.pdf

1、目的:本實驗以小鼠系膜細胞MMC為研究對象,以重組HMGB1為刺激物,試圖通過檢測細胞周期的變化及細胞中PCNA,CyclinD1,CDK4和p16的表達水平,并分析它們之間的相關(guān)性,初步探討HMGB1對系膜細胞的促增殖作用以及對細胞周期調(diào)控相關(guān)因子的影響。
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種常見的由免疫復合物沉積造成多器官損傷的自身免疫性疾病,而狼瘡性腎炎(Lupus

2、 nephritis,LN)在本病中發(fā)生率很高且難以治愈,是本病致死的主要原因之一。系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機制仍不明朗,但通常認為,機體失去正常免疫耐受,淋巴細胞功能異常,從而引起各種細胞因子的分泌和表達紊亂可能是本病發(fā)生機制的核心。高遷移率族蛋白1(high mobility groupprotein box1,HMGB1)作為一種促炎因子,可由單核巨噬細胞,多種免疫細胞及壞死細胞主動合成和主動分泌,經(jīng)與其相應(yīng)受體結(jié)合,激活多種信號轉(zhuǎn)導

3、途徑,從而促進炎性因子的合成及釋放,并與這些炎性因子相互作用,引發(fā)及放大炎癥效應(yīng);同時HMGB1還是一種免疫佐劑,它能夠為免疫細胞提供損傷信號,以啟動免疫效應(yīng),實現(xiàn)對異物的清除,從而介導免疫應(yīng)答的完成。研究顯示,HMGB1參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡,類風濕性關(guān)節(jié)炎,干燥綜合征等多種免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程[1]。我們前期的實驗檢測了HMGB1及其可能受體在狼瘡性腎炎患者的外周血及狼瘡小鼠模型腎組織中的表達水平,結(jié)果顯示:HMGB1及其可能受體

4、在狼瘡性腎炎發(fā)病過程中呈明顯的高水平表達,同時與系膜細胞增生相關(guān),考慮HMGB1可能通過誘導系膜細胞的異常增殖促使了增生性腎小球腎炎的發(fā)生[2],但其對系膜細胞可能的作用機制目前尚缺乏深入研究,因此開展了此次試驗。
　　 方法:選取小鼠系膜細胞MMC為研究對象,隨機分為正常對照組及50pg/L HMGB1刺激組,分別培養(yǎng)4,8和12小時,收集不同時間點細胞,分別以流式細胞術(shù)檢測小鼠系膜細胞的細胞周期分布;免疫細胞化學檢測PCNA

5、蛋白在小鼠系膜細胞中的表達情況;RT-PCR檢測小鼠系膜細胞中CyclinD1mRNA表達的變化,Western Blot檢測小鼠系膜細胞中CyclinD1,CDK4及p16蛋白的表達變化。
　　 結(jié)果:
　　 1 HMGB1刺激后不同時間點小鼠系膜細胞細胞周期分布不同
　　 與正常對照組相比,HMGB1作用至4h～8h,處于G1期的細胞所占比例逐漸減少,而處于S期細胞所占比例增高,增殖指數(shù)PI值(PI=(S期+

6、G2M期)/(S期+G2M期+G0/G1期)×100％)明顯升高,分別為(64.6±0.23)和(69.3±0.15),與正常對照組相比(57.8±0.32)差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);至HMGB1作用12h,PI值(57.5±0.02)與正常對照組相比,無明顯差異。(P＞0.05)(Fig.1)
　　 2 HMGB1刺激早期能夠上調(diào)小鼠系膜細胞中PCNA蛋白的表達
　　 正常情況下,PCNA蛋白的陽性信號以基礎(chǔ)

7、水平量表達于小鼠系膜細胞的細胞核內(nèi),HMGB1作用至4小時,其陽性信號仍存在于細胞核內(nèi),但表達明顯增強,至作用至8小時～12小時,PCNA蛋白的陽性信號仍表達于細胞核內(nèi),表達量逐漸減弱但仍高于基礎(chǔ)水平。(Fig.2)
　　 3 HMGB1刺激能夠升高小鼠系膜細胞中CyclinD1mRNA及蛋白的表達
　　 HMGB1刺激后小鼠系膜細胞內(nèi)CyclinD1 mRNA及蛋白表達趨勢相同。與正常對照組(0.17±0.02,0.3

8、1±0.02)相比,給予HMGB1刺激后4小時,小鼠系膜細胞CyclinD1 mRNA及蛋白的相對表達量均明顯增強(0.59±0.02,0.59±0.03),與正常對照組(0.17±0.02,0.31±0.02)相比,差異具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);HMGB1作用至8小時其表達都逐漸減弱(0.26±0.01,0.27±0.01)，到12小時基本恢復正常(0.13±0.01,0.13±0.02),與正常對照組相比,差異均無統(tǒng)計學差異(

9、P＞0.05))。
　　 4 HMGB1刺激后上調(diào)小鼠系膜細胞中CDK4蛋白的表達
　　 與正常對照組相比(0.67±0.02),小鼠系膜細胞的CDK4蛋白的相對表達量在HMGB1作用4小時時呈明顯增強趨勢(0.88±0.03),與正常對照組相比,差異具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。其表達量在8～12小時降至接近正常水平(0.45±0.02,0.42±0.01),與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)

10、　　 5 HMGB1刺激后能夠時間依賴性的降低小鼠系膜細胞中p16蛋白的表達
　　 與正常對照組相比(1.11±0.02),HMGB1作用后4,8及12小時小鼠系膜細胞中p16蛋白的表達水平呈持續(xù)降低趨勢(0.47±0.02,0.46±0.06,0.14±0.02),呈時間依賴性,與正常對照組相比,差異均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 HMGB1可能是通過上調(diào)細胞周期調(diào)控蛋白CyclinD